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第1篇

【摘要】 目的 建立庫侖陣列電化學高效液相色譜法快速測定大鼠腦組織中的單胺類神經遞質的含量。方法 采用庫侖陣列電化學檢測器檢測去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5羥色胺(5HT)、5羥吲哚乙酸(5HIAA)，采用Phenomenex C18反相色譜柱(150 mm×4.60 mm，5 μm)，流動相為緩沖液乙腈(體積比87∶13)，流速為1 mL·min-1，柱溫為35 ℃。結果 4種單胺類神經遞質的最低檢測限為0.015 15～0.018 15 ng ，回收率為85.3 %～100.5 %。結論 該法具有快速、準確、靈敏、樣品制備簡便等優(yōu)點，可用于大鼠腦組織中單胺類神經遞質的分離檢測。

【關鍵詞】 高效液相色譜法;單胺類神經遞質;庫侖陣列電化學檢測器

(1.School of TCM，Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou Guangdong 510006，China; 2.Taishan Medical University，Taian，Shandong 271016，China)Abstract:Objective To establish a rapid method for determining monoamine neurotransmitters in rats’ brain tissue by HPLC with coularray detector.Methods HPLC was performed on a Phenomenex C18 column(150×4.60 mm，5 micron). The mobile phase，consisted of acetonitrilewater phase(13∶87)，was at a flowrate of 1 mL·min-1. The column temperature was kept at 35 ℃. The levels of NE，DA，5HT and 5HIAA were determined.Results The minimum measurement limit was 0.015 15-0.018 15 ng. The average recoveries were 85.3 %-100.5%.Conclusion This method is rapid，accurate，highly sensitive and easy to operate. The procedure is suitable for determining the monoamine neurotransmitters in rats’ brain tissue.

Key words:HPLC; monoamine neurotransmitters; coularray detector

單胺類物質包括去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5羥色胺(5HT)、五羥吲哚乙酸(5HIAA)等物質，是哺乳動物和人類中樞神經重要的信息傳遞物質。研究該類物質及其代謝產物在體內的含量變化，對于闡明藥物在體內的作用機制，提供了有力的依據。尤其在老年癡呆癥、抑郁癥、兒童多動癥、兒童多動穢語綜合征等疾病與神經遞質含量關系、藥物治療效果等方面的研究中，可提供非常有用的信息[1]。目前文獻報道此類物質常見的檢測方法主要有高效液相色譜電化學檢測器測定法(HPLCECD)、熒光法、放射酶學分析法等[2]。其中以HPLCECD測定法報道的較多，但現(xiàn)有的HPLCECD測定法存在流動相成分復雜[3]、重現(xiàn)性差、檢測時間長、樣品前處理不徹底等問題。本研究改進了現(xiàn)有的測定方法，建立起一種流動相單一、重現(xiàn)性好、檢測時間短、樣品處理完全，并可同時測定4種單胺類物質及其代謝產物的檢測方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

庫侖陣列電化學高效液相色譜儀[Model 5600A16通道檢測器(美國ESA公司)，Model 582 solvent Delivery System，Model 542 自動進樣器，CoularrayWin工作站]，Dionex Tcc100型柱溫箱(美國戴安公司);Thermo D37520型高速冷凍離心機(德國Heraeus公司);pHS25型pH計(上海精密科學儀器有限公司);GenPure超純水系統(tǒng)(德國TKA公司);KQ500型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，功率500 W，頻率40 kHz);3 K超濾管(PALL公司);BP211D電子天平 (德國Sartorious);佳美SK1快速混勻器(江蘇金壇市佳美儀器廠);玻璃勻漿器。

1.2 試藥

去甲腎上腺素(NE，批號100169199402)、多巴胺(DA，批號100070200405)、5羥色胺(5HT，批號111656200401)、5羥基吲哚乙酸(5HIAA，批號140737200501) 均購自中國藥品生物制品檢定所;水為超純水，乙腈為色譜純(德國默克公司)，其余試劑均為分析純。

1.3 動物

SPF級SD大鼠12只，雌雄各半，體質量(180±20) g，由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供[許可證號：SCXK(粵)20080020]。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Luna C18柱(Phenomenex，150 mm×4.60 mm，5 μm)，Alltima C18預柱(Alltech，7.5 mm×4.6 mm，5 μm);流動相：緩沖液[每1 L超純水中含乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)37.2 mg、NaH2PO4 31.2 g、辛烷磺酸鈉1 g，pH值4.0]∶乙腈=87∶13，流速：1 mL·min-1;柱溫箱：35 ℃;自動進樣器溫度：4 ℃;檢測電壓：350 mV;進樣量：15 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 蛋白沉淀工作液的制備 取HCLO4 4.29 mL，加水稀釋至500 mL，得到0.1 mol·L-1 HCLO4溶液，用0.22 μm濾膜濾過，即得。

2.2.2 混合對照品貯備液的制備 精密稱取NE、DA、5HT、5HIAA對照品各1 000 μg，用0.1 mol·L-1 HCLO4定容至2 mL容量瓶中，使其質量濃度均為500 μg·mL-1。取以上4種對照品溶液各500 μL混勻，配制成各對照品質量濃度均為125 μg·mL-1的混合對照品貯備液。

2.2.3 緩沖液的制備 取EDTA 37.2 mg(0.1 mmol·L-1)、NaH2PO431.2 g(0.2 mol·L-1)、辛烷磺酸鈉1 g溶解于1 L 超純水中，H3PO4調pH值至4.0。

2.2.4 供試品溶液的制備 取大鼠禁食12 h后，斷頭處死，在冰臺上迅速分離出大腦組織。將標本稱質量后，錫紙包好，腦組織作為實驗樣品保存于-80 ℃冰箱中。稱取腦組織0.2 g，加入0.1 mol·L-1 HCLO4溶液1 mL，冰浴勻漿。勻漿液渦旋混勻后置4 ℃高速冷凍離心機中12 000 r·min-1離心10 min，取上清液置3 K超濾管中進行二次離心，超濾后清液作為供試品溶液。

2.3 系統(tǒng)適應性試驗

精密吸取蛋白沉淀工作液、混合對照品貯備液、供試品溶液各15 μL，按“2.1”項下色譜條件進行測定，結果見圖1。腦組織樣品中的NE、DA、5HIAA和5HT得到了良好的分離，保留時間分別為2.91、4.36、5.02 和8.34 min，其他雜質不干擾測定結果。

2.4 線性關系考察

取混合對照品貯備液適量，置6個容量瓶中，分別加入0.1 mol·L-1 HCLO4稀釋成不同質量濃度的系列混合對照品溶液，使所含各對照品的質量濃度分別為0.004、0.02、0.1、0.5、2.5、12.5 μg·mL-1，分別精密吸取15 μL 進樣。以各組分的質量濃度(ρ)為橫坐標，各組分的峰面積(A)為縱坐標進行線性回歸，4種單胺類神經遞質的線性關系考察結果見表1。表1 4種單胺類神經遞質的線性關系考察結果

2.5 精密度試驗

分別配制低(0.02 μg·mL-1)、中(0.5 μg·mL-1)、高(2.5 μg·mL-1)3種不同質量濃度的混合對照品溶液，分裝后貯存于-80 ℃冰箱內。日內連續(xù)測5次，計算日內精密度;每份樣本每日測5次，連續(xù)測定5日，計算日間精密度，見表2。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液，分別于0、4、8、12、24 h進樣10 μL，計算各組分峰面積積分值RSD值，分別為1.18%(NE)、3.55%(DA)、1.19%(5HIAA)、0.87%(5HT)，表明供試品溶液在4 ℃條件下放置24 h穩(wěn)定性良好。

2.7 加樣回收率實驗

取大鼠腦組織，經預處理后測定峰面積。再取上述腦組織分別加入低(0.02 μg·mL-1)、中(0.5 μg·mL-1)、高(2.5 μg·mL-1)3種濃度的混合對照品溶液，按照“2.2.4”項下方法制備加樣回收供試品溶液，依法測定，計算回收率，結果見表2。表2 回收率與日內、 日間精密度

2.8 檢測限測定

取“2.4”項下配制的混合對照品溶液(0.004 μg· mL-1)不斷用0.1 mol·L-1 HCLO4稀釋，進樣15 μL，依法測定。以信噪比S/N≥3∶1 時樣品進樣量為該條件下的檢測限，測得各神經遞質的檢測限分別0.018 15(NE)、0.016 05(DA)、0.016 8(5HIAA)、0.015 15(5HT)ng。

3 討論

3.1 樣品處理方法的選擇 在實驗過程中發(fā)現(xiàn)只用HCLO4處理樣品后即進樣測定，柱壓會逐漸上升，甚至造成在線過濾器及電極的堵塞。因此在處理腦組織樣品時，采用超濾管進行二次離心除蛋白，在提高樣品的純度的同時，可減少其對色譜柱及儀器的損害。

3.2 電壓值的選擇 本研究考察了4種神經遞質在-100～600 mV電壓范圍內進行測定的效果。結果在350 mV電壓條件下峰高與電壓比均較大，且基線噪音較小，符合含量測定的要求，因此選用此電壓作為工作電壓。

3.3 色譜條件的選擇 經前期摸索，發(fā)現(xiàn)柱溫、流動相pH值、有機相與水相的配比變化均會影響4種單胺類神經遞質的分離情況。柱溫升高，流動相黏度降低，各組分保留時間均縮短。流動相pH值對5HIAA和5HT的影響較大，而對其它2種神經遞質影響較小，pH值降低可使 5HIAA的保留時間延長，而5HT 的保留時間縮短，NE、DA保留時間變化不大，但各化合物變化幅度不同，因此應將pH值調至固定值。有機相與水相的配比則影響各物質的保留時間及分離度，加大乙腈的量可以明顯縮短分析時間，尤其對5HT影響較大。而因為較高的柱溫和較低的流動相pH值將對儀器及色譜柱造成影響，故在滿足分離的情況下，本實驗采用了35 ℃的柱溫、用H3PO4調節(jié)pH值至4.0的流動相，同時為了縮短檢測時間將乙腈的比例提高至13%。

本實驗建立的方法可以在10 min 內完成生物樣品中4種單胺類神經遞質的測定，并可得到較準確的測定結果。此方法與文獻報道的方法相比具有流動相單一、重現(xiàn)性好、檢測時間短、樣品處理完全等優(yōu)點，可用于臨床上疾病的診斷以及新藥開發(fā)過程中的藥效研究。

參考文獻

[1] 譚炳炎，鄭琳，馮翔.高效液相色譜/電化學法測定大鼠血液和腦組織中單胺類物質的含量[J].分析測試學報，2006，25(2):90-92.