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導(dǎo)語：在基因多態(tài)性的概念的撰寫旅程中，學(xué)習(xí)并吸收他人佳作的精髓是一條寶貴的路徑，好期刊匯集了九篇優(yōu)秀范文，愿這些內(nèi)容能夠啟發(fā)您的創(chuàng)作靈感，引領(lǐng)您探索更多的創(chuàng)作可能。
關(guān)鍵詞：原發(fā)性肝癌 中醫(yī)體質(zhì) 基因多態(tài)性
0引言
原發(fā)性肝癌（primary liver cancer，PLC，以下簡稱肝癌）是常見的惡性腫瘤。由于起病隱匿，早期沒有癥狀或癥狀不明顯，進展迅速，確診時大多數(shù)患者已經(jīng)達到局部晚期或發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，治療困難，預(yù)后差，嚴重威脅著人們的身體健康和命安全。已知原發(fā)性肝癌與肝炎病毒感染、生活方式及環(huán)境等因素相關(guān)，但僅有小部分暴露于這些危險因素的人群發(fā)生肝癌，說明遺傳易感性在其中起著重要的作用。由于代謝酶基因的多態(tài)性，基因變異引起相應(yīng)酶表達的異常，導(dǎo)致個體對毒物或致癌物的反應(yīng)不同，從而對肝癌的易感性也不同，而中醫(yī)體質(zhì)學(xué)是從中醫(yī)角度揭示宿主個體遺傳特征的重要手段?，F(xiàn)對肝癌的中醫(yī)體質(zhì)易感性及分子遺傳相關(guān)指標(biāo)基因多態(tài)性進行初步探析。
1.原發(fā)性肝癌的中醫(yī)體質(zhì)易感性
《黃帝內(nèi)經(jīng)》在一定范圍內(nèi)所闡述的理論已具有體質(zhì)概念的雛形，如《素問？經(jīng)脈別論》云：“勇者，氣行則已;怯者，則著而為病也?！庇虑?，即體質(zhì)的強弱，強調(diào)了體質(zhì)是決定發(fā)病與否的重要因素之一。中醫(yī)體質(zhì)學(xué)說是以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，研究人體各種體質(zhì)特征、類型和生理病理特征，并通過體質(zhì)特征分析疾病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸，是在先天稟賦和后天獲得的基礎(chǔ)上形成的，具有形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理和心理狀態(tài)方面綜合的、相對穩(wěn)定的固有性質(zhì)[1]，并且根據(jù)中醫(yī)理論和四大體質(zhì)特征（形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理機能、心理特點、反應(yīng)特點）提出了9種體質(zhì)類型：平和質(zhì)、氣虛質(zhì)、陽虛質(zhì)、陰虛質(zhì)、痰濕質(zhì)、濕熱質(zhì)、血瘀質(zhì)、氣郁質(zhì)、特稟質(zhì)，并且認為體質(zhì)狀態(tài)決定了發(fā)病與否及發(fā)病的傾向性[2，3]。因此，不同的體質(zhì)特征決定了個體對肝癌的易感性。
中醫(yī)認為，肝癌的產(chǎn)生多傾向于正虛和邪實，如《諸病源候論》：“積聚者，由陰陽不和，臟腑虛弱，受于風(fēng)邪，搏于腑臟之氣所為也?！薄峨s病源流犀燭?積聚Y瘕痃癖痞源流》認為：“壯盛之人，必?zé)o積聚。必氣人正氣不足，邪氣留著，而后患此?！庇捎趥€體體質(zhì)類型不同，對病邪的易感性亦不同。研究發(fā)現(xiàn)肝癌患者的偏頗體質(zhì)主要以氣虛質(zhì)、陽虛質(zhì)和濕熱質(zhì)為主，其高發(fā)體質(zhì)為血瘀質(zhì)，手術(shù)患者以濕熱質(zhì)、血瘀質(zhì)、氣虛質(zhì)為主，并且存在性別差異：男性以氣虛、陽虛和濕熱為主，女性以陽虛質(zhì)為主;并且體質(zhì)類型與西醫(yī)TNM分期及Okuda分期有一定的相關(guān)性，TNMⅠ、Ⅱ期患者以氣虛質(zhì)和陽虛質(zhì)居多，ⅢA期以氣虛質(zhì)和濕熱質(zhì)為主，ⅢB期以上患者以陽虛質(zhì)、氣虛質(zhì)為主。Okuda 分期Ⅰ期、Ⅱ期以氣虛、陽虛和濕熱質(zhì)為主，Ⅲ期以氣虛質(zhì)和陽虛質(zhì)為主[4-6]。
此外，體質(zhì)狀態(tài)可以預(yù)測疾病預(yù)后。預(yù)后與演變的結(jié)果雖然與感邪輕重、治療是否得當(dāng)?shù)扔嘘P(guān)，但在相當(dāng)程度上還是由體質(zhì)因素所決定的，致病因素相同，但由于體質(zhì)差異，轉(zhuǎn)歸預(yù)后也有所不同。研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)體質(zhì)與生存期有一定的關(guān)系，氣虛質(zhì)是影響肝癌預(yù)后的強獨立危險因素，氣虛質(zhì)是預(yù)后最差的一種體質(zhì)[7，8]。
2.原發(fā)性肝癌的基因多態(tài)性
肝癌的發(fā)生發(fā)展是眾多基因與環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。研究表明，代謝酶基因多態(tài)性在肝癌的發(fā)生中有重要作用。環(huán)境致癌物質(zhì)，如吸煙和大量飲酒是患肝癌的危險因素。目前與肝癌相關(guān)的易感基因單核苷酸多態(tài)性（single mucleotide polymorphism，SNP），主要是毒物代謝酶基因、DNA損傷修復(fù)基因等方面。
目前研究較多的代謝酶基因多態(tài)性主要集中在細胞色素P450（cytochrome P450，CYP）超家族、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione Stransferase，GST）、N-乙?；D(zhuǎn)移酶（N-acetyltransferase，NAT）、環(huán)氧化物水解酶（epoxidehydro lase，EH）、乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）等。CYP450 I可以激活香煙中的環(huán)芳烴類致癌物，形成親電子二醇環(huán)氧化物，后者可與DNA結(jié)合，造成了DNA損傷。若DNA修復(fù)不完整，使修復(fù)基因缺陷，則會造成染色體畸變和癌基因、抑癌基因突變，最終造成細胞癌變。研究證實，肝細胞癌（HCC）組織中CYP基因表達下降，而癌旁和正常組織中表達逐漸增加，可推測在HCC發(fā)生發(fā)展過程中，CYP相關(guān)基因表達下調(diào)或失或可導(dǎo)致癌原的活化，從而促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶（Glutathione S-transferases GSTs）是一類非常重要的同工酶超家族，參與眾多親電子致癌物質(zhì)的解毒及多種抗癌藥物的代謝，其中與肝癌研究關(guān)系較多的是GSTM1和GSTT1。長期大量飲酒可使GSTM1和GSTT1的個體患肝癌的危險性顯著升高。微粒體環(huán)氧化物水解酶（microsomal epoxide hydrolase，mEH） 是目前研究最多的環(huán)氧化物水解酶。EPHX1可使環(huán)氧化物水解酶活性下降，使過多的環(huán)氧化物在體內(nèi)蓄積，后者可與DNA鳥嘌呤N7位點共價結(jié)合，引起DNA單鏈的斷裂和堿基變位，可能使肝癌發(fā)生的危險性增加。
此外，致癌物或其代謝產(chǎn)物攻擊機體細胞時也會引起DNA損傷。目前發(fā)現(xiàn)參與人類DNA損傷修復(fù)的基因有130多種。事實證明，不同的組織中，DNA修復(fù)基因缺乏可能會增加患惡性腫瘤的風(fēng)險，如常染色體隱性遺傳疾病中的Bloom綜合征、著色性干皮病等。
3.中醫(yī)體質(zhì)學(xué)說與基因多態(tài)性
中醫(yī)體質(zhì)與基因均表現(xiàn)為先天稟賦的差異。中醫(yī)體質(zhì)學(xué)說認為，體質(zhì)在某種程度上決定著疾病證候的傾向性，同樣又是決定病性、病位、病程階段和病變趨勢的重要因素。而基因是個體體質(zhì)差異的分子學(xué)基礎(chǔ)?；蛟贒NA分子中能表現(xiàn)生理功能的序列，而個體秉承父母的遺傳信息，決定個體在后天的生長過程中要遵循某種既定的內(nèi)在規(guī)律，這種特征在人類的整個生命過程中是不會輕易改變的，同時受先天遺傳因素和后天環(huán)境因素的影響。兩者分別從宏觀與微觀角度闡釋了個體對疾病的易感性?；蚨鄳B(tài)性的研究成果可以從微觀角度探求不同中醫(yī)體質(zhì)類型的遺傳基礎(chǔ)。通過對慢性無癥狀HBV攜帶者（chronic asymptomatic HBV carrier，ASC）陰虛體質(zhì)與人類白細胞抗原（human leukocyte ，HLA）-DRB1、DQA1基因多態(tài)性的內(nèi)在聯(lián)系的探討，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HLA-DRB1*09、HLA-DQA1*0301可能是ASC非陰虛體質(zhì)患者的分子基礎(chǔ);HLA-DRB1*11、HLA-DQA1*0501可能是ASC陰虛體質(zhì)患者的分子基礎(chǔ)，提示HLA-Ⅱ基因多態(tài)性與中醫(yī)體質(zhì)有一定相關(guān)性。而基因多態(tài)性與中醫(yī)體質(zhì)在疾病的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸過程中發(fā)揮了一定的作用。通過觀察中醫(yī)體質(zhì)類型與HBV感染不同臨床狀態(tài)的關(guān)系，同時結(jié)合HLA-DQA1基因多態(tài)性探討中醫(yī)體質(zhì)因素在CHB發(fā)病中的作用，結(jié)果提示，陰虛和痰濕質(zhì)人群感染HBV易發(fā)展為CHB，平和質(zhì)人群則易呈自限性經(jīng)過;對于已感染HBV的人群而言，濕熱質(zhì)者較易或較早發(fā)生肝組織炎癥而導(dǎo)致疾病進展，陰虛質(zhì)、瘀血質(zhì)者也傾向于出現(xiàn)不良結(jié)局，平和質(zhì)與陽虛質(zhì)者更多保持病毒攜帶狀態(tài)。這些研究為臨床通過調(diào)節(jié)病理體質(zhì)，發(fā)揮中醫(yī)治未病的優(yōu)勢，延緩病情進展，并且為中醫(yī)體質(zhì)學(xué)說與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的內(nèi)在聯(lián)系提供一些思路。
中醫(yī)藥治療可以從整體進行功能調(diào)節(jié)。通過對肝癌患者體質(zhì)進行分析，了解疾病的本質(zhì)，根據(jù)肝癌患者體質(zhì)以及其機體表現(xiàn)的不同證型辨證論治，注重調(diào)整患者機體臟腑、陰陽、氣血等體質(zhì)特征，改善機體的代謝能力和免疫能力。已有研究證明，雖然中藥干預(yù)不能直接改變基因結(jié)構(gòu)的作用，但可調(diào)節(jié)基因表達，達到糾正病理狀態(tài)的目的，使體質(zhì)狀態(tài)發(fā)生有利于健康的改變。
4結(jié)語
目前，對原發(fā)性肝癌的中醫(yī)體質(zhì)易感性與基因多態(tài)性之間的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸過程的內(nèi)在機理尚無相關(guān)研究。分子生物學(xué)的發(fā)展使人們認識到，基因多態(tài)性是不同個體在進化過程中基因組與內(nèi)、外環(huán)境相互作用的結(jié)果，是個體對疾病的易感性差別的原因。體質(zhì)是證候形成的基礎(chǔ)。對原發(fā)性肝癌而言，揭示其體質(zhì)、證候與基因多態(tài)性的內(nèi)在關(guān)聯(lián)，采用有效的中藥調(diào)整，減少該病的產(chǎn)生、減緩該病的病程發(fā)展，發(fā)揮中醫(yī)藥治未病的特點和優(yōu)勢。
參考文獻：
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關(guān)鍵詞分子標(biāo)記;概念;基本原理;特點
中圖分類號Q78文獻標(biāo)識碼A文章編號 1007-5739(2009)11-0264-07
隨著人們對生命認識的不斷加深以及遺傳學(xué)的不斷深入發(fā)展,越來越多的遺傳標(biāo)記被發(fā)現(xiàn),遺傳標(biāo)記的種類和數(shù)量越來越多。主要分為4種類型,即形態(tài)標(biāo)記、細胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記和DNA分子標(biāo)記。顯然,前3種標(biāo)記都是以基因表達的結(jié)果(表現(xiàn)型)為基礎(chǔ),是對基因的間接反映;而DNA分子標(biāo)記則是DNA水平遺傳變異的直接反映。與表型標(biāo)記相比,DNA分子標(biāo)記具有能對各發(fā)育時期的個體、各個組織、器官甚至細胞作檢測,既不受環(huán)境的影響,也不受基因表達與否的限制,數(shù)量豐富,遺傳穩(wěn)定,對生物體的影響表現(xiàn)“中性”以及操作簡便等特點。分子標(biāo)記的所有這些特性,奠定了它具有廣泛應(yīng)用性的基礎(chǔ)[1-2]。
1分子標(biāo)記的來源及定義
1.1分子標(biāo)記的來源
“標(biāo)記”一詞,根據(jù)漢語大詞典的解釋,是“便于識別的標(biāo)識或者記號”。隨著人們對生命本質(zhì)認識的一步步加深,在人們研究DNA序列時發(fā)現(xiàn)了大量的非編碼序列,甚至占到了全序列的90%以上。這些非編碼序列具有特殊的一級結(jié)構(gòu),如串聯(lián)重復(fù)、回文結(jié)構(gòu)、Alu序列(反向重復(fù)序列)、CpG島等,并且全基因組分布[3]。隨著人類基因組計劃的人類基因組框架草圖的完成和一個個模式生物的全基因組測序,一個個新的DNA特異序列被發(fā)現(xiàn)并且在染色體上定位,整個基因組內(nèi)的標(biāo)記密度越來越高,并且大量的特異序列與不同的基因片段有著不同程度的連鎖,所有這些標(biāo)記構(gòu)成了人類研究探索各種生物基因組DNA的地圖與路標(biāo)。
1.2分子標(biāo)記的定義
廣義的分子標(biāo)記指可遺傳并可檢測的DNA序列或者蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)標(biāo)記包括種子貯藏蛋白和同工酶(不同基因位點編碼的酶的不同分子形式)及等位酶(同一基因位點上不同的等位基因編碼的酶的不同形式)。狹義的分子標(biāo)記僅僅指DNA標(biāo)記,一般所稱的分子標(biāo)記即被界定在此范圍之內(nèi)[4]。這是因為在應(yīng)用上DNA標(biāo)記比蛋白質(zhì)標(biāo)記廣泛的多。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)比DNA的結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多。構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸有幾十種,而構(gòu)成DNA的堿基只有4種,通過指數(shù)級的排列方式僅是其一級結(jié)構(gòu)的可能性就有數(shù)量級上的差異,且不計蛋白質(zhì)更加復(fù)雜的二級、三級、四級結(jié)構(gòu)及其結(jié)構(gòu)域。并且到目前為止,蛋白質(zhì)的復(fù)制與合成遠不及DNA復(fù)制技術(shù)成熟,可控性也不高。因此,蛋白質(zhì)標(biāo)記應(yīng)用遠不如DNA標(biāo)記方便和廣泛。但從更嚴格的意義上講,蛋白質(zhì)標(biāo)記是研究生命現(xiàn)象更為精確的標(biāo)記,因為其更穩(wěn)定、多態(tài)性更高,每種蛋白質(zhì)都是唯一的(序列唯一、構(gòu)象唯一)。
1.3理想的分子標(biāo)記
理想的分子標(biāo)記必須達到以下要求:①具有高多態(tài)性;②共顯性遺傳,即利用分子標(biāo)記可鑒別二倍體中雜合和純合基因型;③能明確辨別等位基因;④遍布整個基因組;⑤除特殊位點的標(biāo)記外,要求分子標(biāo)記均勻分布于整個基因組;⑥選擇中性(即無基因多效性);⑦檢測手段簡單、快速(如實驗程序易自動化);⑧開發(fā)成本和使用成本盡量低廉;⑨在實驗室內(nèi)和實驗空間重復(fù)性好(便于數(shù)據(jù)交換)[5]。
特別需要提出的是,所有的分子標(biāo)記都必須滿足和某個基因或者已知標(biāo)記緊密連鎖(連鎖程度越高越好)甚至共分離。
但是,目前發(fā)現(xiàn)的任何一種分子標(biāo)記均無法同時滿足以上所有要求。使用者可以根據(jù)自己的實驗?zāi)康暮鸵缶唧w選用某種標(biāo)記技術(shù)。
2目前常用分子標(biāo)記的基本原理
2.1限制性片斷長度多態(tài)性(RFLP)
限制性片斷長度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Pol-ymorphism)是指用限制性內(nèi)切酶處理不同生物個體的DNA所產(chǎn)生的分子片斷大小的差異。此技術(shù)基于生物個體的基因組的變異,是研究不同基因組間的差異的技術(shù),由Grod-zicker于1974年首先提出。其基本原理是:物種經(jīng)過長期的進化,各個種屬甚至品種之間的同源DNA序列上的限制性內(nèi)切酶識別位點不同,或者由于突變、重組等原因引起限制性內(nèi)切酶位點上的核苷酸的變化。若引起DNA分子某一特定內(nèi)切酶識別位點序列內(nèi)發(fā)生變化,這樣該位點就不能被切開,使得DN段比親本長;若突變后形成新的酶切位點,則酶切后的片斷變短。這樣,通過電泳可以將大小不同的片斷區(qū)分開來。對于分子量較小的質(zhì)粒DNA就可直接觀察到DNA長度的差異,但對于核DNA而言,DN斷呈連續(xù)分布,無法辨別差異,需通過Southern雜交轉(zhuǎn)移至支持膜上,用單拷貝或低拷貝的DNA克隆作為探針與膜上的酶切片斷雜交,通過放射自顯影或非同位素顯色技術(shù),發(fā)生變異的材料顯示的帶就可能與親本的帶處于不同位置。檢測出與此標(biāo)記DNA相關(guān)的片段構(gòu)建出多態(tài)性圖譜,即為RFLP[5,6]。這種特定的限制性片斷與DNA探針的組合,便可以作為遺傳標(biāo)記。由于RFLP起源于DNA的變異,不受顯隱性關(guān)系、環(huán)境條件和發(fā)育階段的影響,具有遺傳的專一性和穩(wěn)定性的特點,在數(shù)量上不受限制,可隨機選取足夠數(shù)量能代表整個基因組的RFLP標(biāo)記,而且每個標(biāo)記變異大,檢測方便。用于檢測RFLP的克隆探針可隨機選取,可以是使核糖體DNA、葉綠體DNA,也可以是總DNA。這樣就可以獲得能夠反映遺傳差異的大量多態(tài)性,為進行資源分析、品種鑒定、物種進化、基因定位、親緣關(guān)系和遺傳距離的分析,遺傳圖譜的構(gòu)建提供了有力的工具。并且RFLP是共顯性標(biāo)記,能夠區(qū)別出雜合體與純合體[7]。雖然RFLP具有結(jié)果穩(wěn)定可靠,重復(fù)性好,特別適合建立連鎖圖等優(yōu)點,但也具有檢驗步驟多、周期長、成本高等缺點。并且RFLP對DNA多態(tài)性檢出的靈敏性不高,RFLP連鎖圖譜上還有很大的空間區(qū)(gap),甚至在使用同位素時可能對人有一定的傷害等等,這些都是需要進一步完善的地方。
2.2隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)
隨機擴增多態(tài)性DNA(Random Amplified Polymorphi-sms DNA)是美國杜邦公司的Williams和加利福尼亞生物研究所的Welsh等領(lǐng)導(dǎo)的2個小組于20世紀90年代同時開發(fā)出來的一種新的DNA指紋技術(shù)。此技術(shù)是應(yīng)用一系列隨機引物擴增并尋找多態(tài)性DN段的遺傳標(biāo)記技術(shù)。這一技術(shù)建立于PCR反應(yīng)基礎(chǔ)之上,以隨機的短脫氧核苷酸(通常為10個堿基)作為PCR引物,對基因組DNA進行擴增而產(chǎn)生多態(tài)的DNA圖譜。擴增產(chǎn)生的片段可通過瓊脂糖電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳分開,經(jīng)溴化乙錠染色或銀染色得到多態(tài)性的DNA圖譜后進行多態(tài)性觀察。在基因組上,每個引物可以連續(xù)直接擴增特定的DN段,對一個特定的基因型來講,這些擴增的片段或片段的類型是唯一的。它的應(yīng)用是基于這樣的一個理論:對于同一模板DNA,用同一引物擴增既可能得到相同的帶譜(模板基因組間可能具有同源性),也可能得到不同的帶譜。僅在某一特定模板中出現(xiàn)的條帶即可作為該模板的分子標(biāo)記[8,9]。事實上,不同基因組DNA總是有一定差異的,所以用RAPD即可進行分子標(biāo)記研究。理論上講,在一定的擴增條件下,擴增的條帶數(shù)取決于基因組的復(fù)雜性。對特定的引物,復(fù)雜性越高的基因組所產(chǎn)生的擴增條帶數(shù)也越多。
RAPD所用的一系列引物的DNA序列雖然各不相同,但對于某一特定引物來說,它同基因組DNA序列有特定的互補區(qū)域。這些特定區(qū)域在基因組的分布如果符合PCR擴增的反應(yīng)條件的話,即引物在模板上的2條鏈如果有互補位置并且與引物的3′端在200bp以內(nèi),就可以擴增出這一片段。如果基因組在這些區(qū)域內(nèi)發(fā)生插入、缺失或者替換即可導(dǎo)致這些特定的結(jié)合位置分布發(fā)生變化而使PCR產(chǎn)物發(fā)生增加、缺失或者分子量發(fā)生改變,通過對PCR產(chǎn)物的檢測,即可找出基因組DNA在這些區(qū)域內(nèi)的多態(tài)性[10]。由于RAPD分析時所用的引物數(shù)量極大,并且引物序列隨機,雖然對某一引物而言檢測的區(qū)域有限,但是利用一系列引物可以檢測的區(qū)域幾乎可以覆蓋整個基因組。與RFLP是從一系列酶切片段中尋找多態(tài)性片段不同,RAPD是利用PCR隨機合成多態(tài)性DN段,檢測被擴增區(qū)域內(nèi)的遺傳特征變化。其具體優(yōu)點體現(xiàn)在:①極大的豐富性,能反映整個基因組的變化;②強大的可探測性,無需合成特定的引物;③高效性與靈敏性。短期內(nèi)可以得到大量的擴增片段,只要是遺傳特異性的發(fā)生變化,即使親緣關(guān)系很近的個體也可以識別出[11]。
RAPD最大的特點是引物的堿基序列是隨機的,所用引物通常多達幾百種,并且1套引物可以用作多個物種或者群體,所以RAPD技術(shù)在用于遺傳多樣性和品種鑒定的研究中具有極大的優(yōu)越性。因此,用來鑒定品種純度是很有用的。據(jù)報道[9],從玉米、大豆、小麥及紅三葉草干種子中提取DNA并成功地利用RAPD技術(shù)擴增DN段;中國科學(xué)院遺傳所陳洪等利用OPP-18引物成功地鑒定了雜交水稻汕優(yōu)63雜種純度,鑒定結(jié)果與田間小區(qū)種植鑒定完全一致。RAPD技術(shù)反應(yīng)靈敏、多態(tài)性強,操作簡便,速度快,費用低,既有大量的隨機引物可供篩選之用,又不受種屬的限制,被廣泛用于多種作物的種子鑒定[9,11,12]。
由于是隨機引物對整個基因組進行多態(tài)性檢測,在技術(shù)上簡單易行不需要克隆制備、同位素標(biāo)記、Southern印記等預(yù)備性工作,所需DNA樣品量少,安全性好,價格便宜,是繼RFLP之后應(yīng)用最廣的分子標(biāo)記。由于引物沒有特異性,1套引物可用于不同生物基因組的的分析,分析速度快,短期內(nèi)可得到大量的遺傳標(biāo)記,并克服了同工酶位點少和RFLP操作技術(shù)復(fù)雜的弊端,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于遺傳作圖、基因定位和克隆、物種進化及鑒定特殊染色體區(qū)段的鑒別和分離以及動植物育種等方面,特別是在尋找與目的基因連鎖的分子標(biāo)記方面,近年來報道了大量的與各種目的基因連鎖的RAPD標(biāo)記。水稻的Xa-21 基因和西紅柿的pto基因的成功分離就是首先找到了與目的基因緊密連鎖的RAPD標(biāo)記,然后通過定位克隆的方法克隆了目的基因[13]。
與PCR相比,RAPD具有以下特點:①RAPD使用的是隨機引物,不需要預(yù)先了解目的基因和相應(yīng)的序列;②操作簡便,實驗周期短,能在較短的時間篩選大量樣品;③引物具有普遍適應(yīng)性,適用于自動化操作分析。
與RFLP相比,RAPD具有以下特點:①RAPD分析只需要少量模板,1次擴增僅需20~100ng,這對于DNA量很少的材料進行基因組分析有利。比如對花粉粒、原生質(zhì)體、種子等的DNA分析是切實可行的。②RAPD標(biāo)記具有更大的隨機性,亦有利于圖譜的構(gòu)建。對于DNA含量大的和多倍體物種,RFLP探針會與多倍體的多個片段雜交,所得到的混合指紋會對其他等位基因的闡明帶來困難。而且由于DNA量較大,進行單拷貝的Southern雜交不很實際,至少需要很長的曝光時間,并且已知的探針數(shù)量有限。RAPD大大增加了可構(gòu)建遺傳圖譜物種的數(shù)量。③無需借助于有傷害性的同位素,耗費的人力物力少。④靈敏度高。引物中的個別堿基的變化會引起擴增條帶和強度的劇烈變化,這是RFLP所無法比擬的。短期內(nèi)可以得到大量的擴增片段,只要是遺傳特異性發(fā)生變化,即使親緣關(guān)系很近的個體也可以識別出。⑤RAPD標(biāo)記可以覆蓋整個基因組,包括編碼和非編碼區(qū),可以反映整個基因組的變化。但是,由于引物的競爭性等,基因組的RAPD位點有時不能全部檢出,造成假象上的差異,這在種屬親緣關(guān)系的研究上尤其明顯。⑥RAPD產(chǎn)物有大于50%的條帶擴增于單拷貝區(qū),經(jīng)過克隆和序列分析后,可作為RFLP和原位雜交的探針,在基因定位、克隆及輔助選擇育種中可以廣泛應(yīng)用。
隨著RAPD日益廣泛的使用,其不足之處也逐漸顯現(xiàn),比如標(biāo)記的顯隱性位點性,致使其不能在后代中區(qū)分雜合體和純合體;穩(wěn)定性差,由于是單鏈引物隨機的結(jié)合,在眾多的反向重復(fù)序列上,每次的實驗結(jié)果可能不一致。解決辦法是對單鏈引物進行篩選,優(yōu)化PCR條件;高度的變異性,即使在親緣關(guān)系很近的物種間,結(jié)果也可能差異極大;Tm值低的隨機引物易受外界環(huán)境影響,如Mg2+濃度等[8,9,14]。
由于RAPD技術(shù)是由多種成分參加的生化反應(yīng),反應(yīng)中各種成分均為微量,盡管其反應(yīng)靈敏度高,但是影響因素較多,故而RAPD受環(huán)境影響很大,穩(wěn)定性差,重復(fù)性也不好,因此對實驗的設(shè)備、條件及其操作的一致性很嚴格,這又大大限制了它的使用。為了得到較穩(wěn)定的結(jié)果,各種反應(yīng)參數(shù)必須事先優(yōu)化選擇,操作中每一步都必須小心謹慎,以防止出現(xiàn)差錯。
2.3特征序列擴增區(qū)域(Sequence-characterized amplified regions,SCAR)
RAPD標(biāo)記一般表現(xiàn)顯性遺傳,但若某RAPD片段不是重復(fù)序列,也可將其轉(zhuǎn)化為RFLP標(biāo)記。另外,為了提高某一理想RAPD標(biāo)記的穩(wěn)定性,可首先將其克隆并對其末端測序,之后,在原來RAPD所用的10bp引物上增加合成上述末端序列的14bp的核苷酸,以此為引物對基因組DNA再行擴增分析,此即SCARs(Sequenced Characterized Amplified Regions)標(biāo)記[15]。
SCAR首先由Parar和Michlmore(1993)提出并應(yīng)用。SCAR標(biāo)記是在RAPD技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。其基本步驟是:先作RAPD分析,然后把目標(biāo)RAPD片段(如與某目的基因連鎖的RAPD片段)進行克隆和測序,根據(jù)原RAPD片段兩末端的序列設(shè)計特定引物(一般比RAPD引物長,通常24個堿基,是在原RAPD引物的3′與5′端延長14個堿基),利用兩端各24個堿基的引物再進行PCR特異擴增,這樣就可把與原RAPD片段相對應(yīng)的單一位點鑒定出來。這樣的位點就稱為SCAR?？偟膩碚f,SCAR比RAPD和其他利用隨機引物的方法在基因定位和作圖中的應(yīng)用更好,因為它有更高的可重復(fù)性(原因是使用的引物長),標(biāo)記是共顯性遺傳的[16]。
該方法與RAPD相比,具體有如下優(yōu)點:①由于有較長的引物,退火溫度較高,因此具有更高的檢測穩(wěn)定性;②有將顯性RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化為共顯性的SCAR標(biāo)記的可能性;③如果是顯性標(biāo)記,則在檢測中可以直接染色而不需電泳檢測。另外,用RAPD找到擴增片段后不再設(shè)計引物,而是直接測序后通過電腦軟件分析(如用ClustalX軟件進行對位,MEGA軟件計算DNA序列間的差異百分率和轉(zhuǎn)換/顛換數(shù),UPGMA軟件建親緣關(guān)系樹狀圖等),找出特異性的堿基作為鑒定的特異性標(biāo)記[17]。
2.4與RAPD技術(shù)相近的分子標(biāo)記種類
下面提到的所有技術(shù)都是利用1個或2個短的富含GC堿基的隨機引物。
(1)DNA擴增指紋圖譜(DNA amplification fingerprint-ing,DAF)[18]。與RAPD技術(shù)不同的是,在DAF分析中,引物濃度更高,引物長度更短(一般5~8個堿基),只有2個溫度循環(huán)(在RAPD中是3個溫度循環(huán)),并且往往用聚丙烯酰胺凝膠電泳,DAF通常會產(chǎn)生非常復(fù)雜的帶型。
(2)任意引物PCR(arbitrarily primed polymerase chain reaction, AP-PCR)。AP-PCR使用的引物較長(10~50個堿基),但PCR反應(yīng)前2個循環(huán)的嚴謹條件較低,最終的反應(yīng)結(jié)果與RAPD類似[19]。在AP-PCR分析中,擴增分為3個部分,每個部分要求的條件和組分的濃度存在差異;在第1個PCR循環(huán)中,引物濃度較高;引物長度不定,并且常常來自為其他目的而設(shè)計的引物(如M13通用測序引物)。
2.5擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)
擴增片段長度多態(tài)性(Amplified Fragment Length Poly-morphism),亦稱選擇性限制片段擴增(SRFA, Selective Res-triction Fragment Amplification),是荷蘭Keygene公司的Za-beau Marc和Vos Pieter于1993年創(chuàng)建的一種新型的分子標(biāo)記,并于當(dāng)年獲得了歐洲專利局專利[20]。
它是RFLP和PCR相結(jié)合的分子標(biāo)記技術(shù),既有RFLP的可靠性,又有PCR(如RAPD)的靈敏性,多態(tài)性高。其基本原理是利用PCR技術(shù)選擇性擴增基因組DNA雙酶切后產(chǎn)生的限制性片斷?；蚪M經(jīng)2種限制性內(nèi)切酶消化以后將一雙鏈DNA人工接頭(artificial adapter)連接于限制性片斷兩端。然后根據(jù)接頭序列和限制性位點附近的區(qū)域的堿基序列,設(shè)計一系列3′端含數(shù)個隨機變化的選擇性堿基的PCR引物進行特異性條件擴增,只有那些限制性位點的側(cè)翼序列與引物3′端選擇堿基相匹配的限制性片段才能得以擴增。這些選擇性堿基數(shù)目的多少主要是由待測樣品的基因組大小決定,選擇性堿基數(shù)目多,選擇性就強,擴增產(chǎn)物就少;反之,其數(shù)目就少,選擇性弱,擴增產(chǎn)物就多。擴增產(chǎn)物經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離顯示其多態(tài)性。當(dāng)不同基因組DNA中因為突變引起限制性位點的數(shù)量發(fā)生改變或2個限制性位點之間的區(qū)域內(nèi)發(fā)生堿基插入、片段消失或順序重排時,電泳譜帶顯示多態(tài)性,多態(tài)性以擴增片段的長短不同和數(shù)量多寡顯示出來[21]。
AFLP的技術(shù)特點包括以下幾個方面:①使用2種內(nèi)切酶消化模板DNA。一些酶的切割位點較多,如MseI、TaqI、XbaI等,另一些酶切位點較少,如PstI等等。采用雙酶切割的原因是:多切點酶產(chǎn)生小片段,便于凝膠分析切點數(shù)少的酶減少擴增片段,由于AFLP反應(yīng)中擴增片段是2個酶共同酶切的片段,這樣減少了選擇擴增時所需的選擇堿基數(shù)。雙酶可以進行單鏈標(biāo)記,從而防止電泳中因為雙鏈泳動不均而產(chǎn)生的雙帶假象。并且可使少量引物產(chǎn)生許多不同的引物組合,從而產(chǎn)生大量的不同的AFLP指紋圖譜[22]。另外,不同物種基因組的AFLP過程中使用的限制性內(nèi)切酶也不盡相同。EcoRI可靠廉價,是6堿基內(nèi)切酶的首選。分析真核生物基因組時大多使用MseI(4堿基),因為MseI的識別序列是TTAA,而真核生物基因組富含AT序列,與TaqI相比(其識別序列為TCGA),可以獲得更多的便于PCR擴增和電泳分離的小片段DNA[23]。②AFLP的接頭為雙鏈寡核苷酸。人工合成時接頭未進行磷酸化處理,所以只有1條單鏈連接于酶切片段的末端。③與常規(guī)的PCR相比,AFLP的引物有其獨特性。其引物有3部分構(gòu)成:與接頭互補的核心序列、內(nèi)切酶識別序列以及3′末端的選擇性堿基。該類引物的一個重要特征是通常以鳥苷酸G開頭,這樣可以有效的形成雙鏈,不過當(dāng)dNTP濃度過低時容易形成雙鏈結(jié)構(gòu)。此外,選擇性堿基的數(shù)目影響著AFLP反應(yīng)的特異性。研究表明,引物帶有1~3個選擇性堿基時擴增的選擇性較好。當(dāng)選擇性堿基超過4個時,擴增的錯配程度超過了允許程度,故而AFLP的選擇性堿基數(shù)目一般不超過3個,具體數(shù)目取決于基因組的大小。研究表明,分析500Mbp以下的植物基因組時用EcoRI+2(2個選擇性堿基)/MseI+3引物組,500~6 000 Mbp的基因組應(yīng)采取EcoRI+3/MseI+3較為嚴謹?shù)囊锝M。微生物通常采用1個選擇性堿基的引物組[24]。④AFLP的PCR擴增分兩步進行。首先預(yù)擴增,其擴增產(chǎn)物經(jīng)過一定比例稀釋后,以此為模板再進行選擇性擴增。兩步擴增可以減少擴增產(chǎn)物中的非特異性帶,降低了不清晰電泳造成的指紋圖譜的背景,提高了指紋圖譜的清晰度,還可以增加擴增片段數(shù),為AFLP分析提供充足的模板。
AFLP技術(shù)不僅具有其他分子標(biāo)記的優(yōu)點,即位點數(shù)量無限,呈典型的孟德爾遺傳,無表型、復(fù)等位效應(yīng),不受環(huán)境影響等,還具有一些獨特的優(yōu)越性,如標(biāo)記異常豐富,典型的AFLP反應(yīng)中,1次電泳可得到100~150個擴增產(chǎn)物,其他標(biāo)記技術(shù)難以達到。穩(wěn)定性、重復(fù)性好,應(yīng)用非常廣泛,可用于任何生物基因組的遺傳分析。與PCR技術(shù)結(jié)合,可在短時間內(nèi)得到大量多態(tài)性標(biāo)記。同時對模板濃度不敏感,模板需求量也小。Vos Pieter在對番茄基因組AFLP分析時,證實了模板濃度在相差1 000倍以內(nèi)(0.000 5~25ng)獲得的指紋圖譜基本一致。另外,在AFLP中標(biāo)記的引物會全部耗盡,引物耗盡后,擴增的帶型不受循環(huán)數(shù)的影響。這樣模板濃度即使不一致也可以通過增減循環(huán)次數(shù)的方法獲得強度一致的帶型。目前,AFLP是構(gòu)建基因組特定區(qū)段高密度連鎖圖譜的最有效的方法。此外,AFLP全基因組分布非常適合構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。AFLP也可以用于檢測DNA庫(DNA pool)克隆的DNA大片段的多態(tài)性,而且其多態(tài)性的標(biāo)記大多對應(yīng)于基因組的某一位置,這樣就可以和STS一樣,成為遺傳圖譜(genetic map)和物理圖譜(physical map)之間的橋梁[25,26]。
實際操作中,影響AFLP指紋圖譜結(jié)果的因素很多。因此,應(yīng)采取質(zhì)量高、純度好、分子量大的的基因組DNA作為模板。如果模板中含有其他雜質(zhì)或者DNA降解很嚴重,導(dǎo)致酶切不完全,許多未經(jīng)酶切的模板片段經(jīng)電泳后產(chǎn)生表現(xiàn)為高分子量的條帶(假帶),導(dǎo)致不能真實地反映被測物種的多態(tài)性。為了避免電泳的條帶過多或者過少,應(yīng)對PCR反應(yīng)體系進行優(yōu)化,篩選出最佳的引物組合。PCR擴增時,應(yīng)在模板變性之前加入Tag酶和dNTP,否則會導(dǎo)致擴增失敗。反應(yīng)體系中的dNTP濃度不能過低,否則擴增產(chǎn)物容易形成雙鏈結(jié)構(gòu)[21,27]。
2.6序列標(biāo)簽位點(STS)
序列標(biāo)簽位點(Sequence -Tagged Site,STS)指的是一段序列已知并且能夠在基因組中作為“路標(biāo)”使用的DNA序列,是對由特定引物序列所界定的一類DNA標(biāo)記的統(tǒng)稱。其最大特點就是利用特異PCR,因此結(jié)果非?？煽?。顯然,成為STS必須滿足2個條件:①序列已知;②位置確定并唯一。從理論上講,任何一段DNA都可以成為STS。但是,由于需要的是與某一個目標(biāo)性狀基因或已知的標(biāo)記緊密連鎖的DN段,因此能夠利用的STS數(shù)量則非常有限。根據(jù)單拷貝的DN段兩端的序列設(shè)計1對特異引物擴增基因組DNA,產(chǎn)生的一段長度為幾百bp的特異序列在基因組中往往只出現(xiàn)1次,從而能夠界定基因組的特異位點。在人類基因組作圖中已用其作為將遺傳圖譜與物理圖譜整合的共同位標(biāo),這在基因組作圖上具有非常重要的作用。隨著大量的模式生物的全基因組測序,會有越來越多的可利用的STS被發(fā)現(xiàn)。
2.6.1表達序列標(biāo)簽標(biāo)記(Expressed Sequence Tags,EST)。EST是指一小段(通常長度300~500bp)單次重復(fù)的mRNA序列或cDNA序列。它們在特定的組織或者特定的時期內(nèi)特異的表達,可以看作是特定的cDNA文庫中的標(biāo)記。EST計劃由美國科學(xué)家Venter于1989年提出,并首先應(yīng)用于人類基因組研究,之后被廣泛用于植物基因組研究,它是通過大規(guī)模的cDNA隨機測序,從而獲得對基因組認識的一種研究策略。目前,許多國家和組織正在開展某些作物基因組EST計劃的研究,如成立于1998年的國際小麥族EST協(xié)作網(wǎng)(International Triteace EST corperation,ITEC),就是致力于麥類EST研究和開發(fā)的[28]。近幾年來,國際公共數(shù)據(jù)庫中的EST序列呈指數(shù)增長,截止到2006年8月,美國生物信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫Genbank已公布涉及205 000種生物的61 132 599條EST序列,總長度共65 369 091 950bp。
快速增長的ESTs數(shù)據(jù)為SSR標(biāo)記的開發(fā)提供了一個巨大的有價值的來源。首先,避免了傳統(tǒng)SSR標(biāo)記開發(fā)需要構(gòu)建基因組DNA文庫等煩瑣步驟,而且從ESTs中發(fā)掘出的SSR只是ESTs測序計劃的副產(chǎn)品,從而節(jié)省了大量人力物力[29];其次,其本身是功能基因的一部分序列,所以它將為功能基因提供“絕對”的標(biāo)記[30]。同時,由于不同物種間基因共線性和保守性,從一種作物中開發(fā)的EST-SSR可同時用于其他作物研究,從而能夠為比較基因組學(xué)和同源基因克隆提供新的途徑[31]?，F(xiàn)在EST-SSR已被用于構(gòu)建遺傳圖譜、分離與鑒定新基因、基因表達差異研究、比較基因組研究和制備DNA芯片等方面。
另外,還有一種被稱為GSS序列的標(biāo)記。GSS序列本質(zhì)上和EST序列是一樣的,不同之處是它的序列直接來源于基因組而不是mRNA或cDNA。它通常有以下幾種來源:①全基因組檢測得到的特異/單次重復(fù)序列;②來自質(zhì)粒/BAC/YAC克隆所得到的單次重復(fù)序列;③基因組外顯子捕獲;④通過Alu―PCR得到的序列。
2.6.2微衛(wèi)星(SSR)。微衛(wèi)星(microsatellite)又叫做簡單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat)或者短串聯(lián)重復(fù)序列(Short trandem repeat,STR)、簡單序列長度多態(tài)性(Simple Seque-nce Length Polymorphism,SSLP)。簡單序列重復(fù)多態(tài)性(Si-mple Sequence Repeat Polymorphisms,SSRP)微衛(wèi)星指的是真核生物普遍存在的遍布整個基因組的排列為2~5個核苷酸的短串聯(lián)重復(fù)序列,如(CA)n、(GT)n、(CAG)n等,尤以(CA)n重復(fù)序列最為常見,其長度由重復(fù)單位的拷貝數(shù)決定。在真核生物基因組中微衛(wèi)星很豐富,通常長度能夠達到150bp,是一類呈高度多態(tài)的遺傳標(biāo)記,不僅可用于基因組遺傳連鎖圖的構(gòu)建以及基因的定位與克隆,而且可用于遺傳性疾病的連鎖分析和基因診斷。其重復(fù)單位數(shù)目的改變可以引起相當(dāng)高的多態(tài)性,但突變率僅為0.5×10-4~5.0×10-4,在家系中可以穩(wěn)定地遺傳,是一種很好的遺傳標(biāo)志[32]。
微衛(wèi)星約占真核基因組的5%,其基本構(gòu)成單位一般為1~8bp,多位于編碼區(qū)附近,也可位于內(nèi)含子、啟動子及Alu序列(反向重復(fù)序列)中。人類基因組約有5~10萬個(CA)n重復(fù)序列。通常認為重復(fù)序列的產(chǎn)生是由于在遺傳物質(zhì)復(fù)制過程中DNA滑動或在有絲分裂、減數(shù)分裂期染色體不對等交換所致,因此該重復(fù)序列多存在于不經(jīng)嚴格選擇的基因組區(qū)域。目前普遍認為微衛(wèi)星充當(dāng)基因重組的熱點是基因重排和變異的來源[33]。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instabi-lity,MSI)是指由于復(fù)制錯誤(replication error,RER)引起的簡單重復(fù)序列的增加或丟失,也稱RER陽性或RER表型。MSI首先在結(jié)直腸癌中觀察到。微衛(wèi)星通過改變DNA結(jié)構(gòu)或通過與特異性蛋白質(zhì)結(jié)合而發(fā)揮其基因調(diào)控作用。
由于微衛(wèi)星的寡核苷酸在同一物種的不同基因型之間差異很大,可以利用特異引物進行PCR擴增。引物根據(jù)與微衛(wèi)星重復(fù)序列兩翼的特定保守序列設(shè)計,用來擴增重復(fù)序列本身。由于重復(fù)的長度變化極大,所以這是檢測多態(tài)性的1種有效方法[34]。其特點包括:一般檢測到的是1個單一的多等位基因位點;共顯性遺傳,故可鑒別雜合子和純合子;得到的結(jié)果復(fù)性很高。為了提高分辨力,通常使用聚丙烯酰胺凝膠電泳,它可檢測出單拷貝差異。也可以在同1個反應(yīng)試管中把PCR反應(yīng)與不同的SSR引物結(jié)合起來(稱為multiplexing),這可節(jié)省時間,但是,這只能在不同引物的產(chǎn)物在大小上下不重疊的情況下才能使用[35,36]。很顯然,使用SSR技術(shù)的前提是需要知道重復(fù)序列兩翼的DNA序列的信息,這一方面可以在其他種的DNA數(shù)據(jù)庫中查詢,否則就必須先建立含有微衛(wèi)星的基因組文庫,再從中篩選可用的克隆,進行測序,然后設(shè)計合適的引物。同時,這種由保守序定的微衛(wèi)星序列也具有染色點的特異性,因此1981年Miesfeld等首次發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星后,很快成為1種常用高效的分子標(biāo)記。統(tǒng)計分析表明,不同的物種其微衛(wèi)星的突變頻率也是穩(wěn)定的。SSR的PCR引物也是對某一高變重復(fù)位點高度專一的。用特定引物擴增出相應(yīng)的微衛(wèi)星片段后,再通過電泳分離,差異可經(jīng)過EB或者銀染后觀察。一般種群可顯示出超過10種類型的等位基因。微衛(wèi)星不僅重復(fù)單位變異數(shù)大,而且其重復(fù)區(qū)域總長度又在PCR易于擴增的區(qū)域,快速簡便,所需的DNA用量小。與等位酶相似,微衛(wèi)星是具有獨立的共顯性基因。由于微衛(wèi)星的遺傳中性并且比等位酶法有更多的可供檢測的等位基因,這樣就可以提供更加精細的基因變化的范圍,因此在種群研究上有著更大的應(yīng)用[3,34,37-39]。
簡而言之,微衛(wèi)星的最大優(yōu)點在于通過簡單的PCR擴增即可直接檢測到已知的特定的染色點,不僅具有一般PCR操作簡單、快速、成本低的特點,還具有RFLP的穩(wěn)定可靠、特異性、共顯性等特點,不足之處是其引物開發(fā)難度較大,技術(shù)復(fù)雜,周期長,成本也高。不過隨著眾多模式生物的全基因組測序的飛速進展,對全基因組了解的日益全面,各個大型數(shù)據(jù)庫的逐步完善,并且借助越來越發(fā)達的計算機計算和預(yù)測技術(shù),使得開發(fā)成本有所降低。
2.6.3其他具有特定引物的分子標(biāo)記種類。
(1)加錨微衛(wèi)星寡核苷酸(Anchored microsatellite oli-gonucleotides)。Zietki-ewicz et al(1994)對SSR技術(shù)進行了發(fā)展[40],他們用加錨微衛(wèi)星寡核苷酸作引物,對基因組節(jié)段而不是重復(fù)序列本身進行擴增。在SSR的5′端或3′端加上2~4個隨機選擇的核苷酸,這可引起特定位點退火。這樣就能導(dǎo)致位于反向排列的間隔不太大的重復(fù)序列間的基因組節(jié)段進行PCR擴增。這類標(biāo)記又被稱為ISSR(inter-simple sequence repeat)、ASSR(anchored simple sequence repeats)或AMP-PCR。這類標(biāo)記往往是顯性遺傳的。在所用的兩翼引物中,可以1個是ASSR引物,另1個是隨機引物。如果1個是5′端加錨的ASSR引物,另1個是隨機引物,則被稱為RAMP技術(shù)。
(2)CAPS(Clea-ved amplified polymorphic sequence)。CAPS技術(shù)又可稱為PCR-RFLP。所用的PCR引物是針對特定的位點而設(shè)計的。其基本步驟是:先進行PCR擴增,然后將PCR擴增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶酶切,再用瓊脂糖凝膠電泳將DN段分開,用EB染色,觀察。與RFLP技術(shù)一樣,CAPS技術(shù)檢測的多態(tài)性其實是酶切片段大小的差異。在酶切前進行RCR產(chǎn)物檢測,其多態(tài)性稱為ALP。Neff et al.(1998)在此基礎(chǔ)上又發(fā)展出dCAPS技術(shù)(derived CAPS),這是檢測單核苷酸多態(tài)性的一種良好方法。
(3)單引物擴增反應(yīng)(single primer amplification reaction,SPAR)。SPAR技術(shù)與RAPD技術(shù)相似的是也只用1個引物,但SPAR分析中所用的引物不是隨機的,而是在SSR的基礎(chǔ)上設(shè)計的,例如可能的序列是(TA)10或(CGA)6。擴增的是SSR之間的DNA序列。又稱為MP-PCR(microsate-llite-primed PCR)。
(4)小衛(wèi)星區(qū)域DNA直接擴增(directed amplification of minisatellite region DNA,DAMD)。直接用小衛(wèi)星的核心序列作引物進行擴增。
(5)Inter-Alu PCR like genomic profiling。與SPAR技術(shù)相近,也只用1個引物,但所用的引物是在Alu序列(反向重復(fù)序列)的基礎(chǔ)上設(shè)計的,擴增的是copia(另一種反向重復(fù)序列)序列之間的DNA序列。
(6)ISTR(inverse sequence-tagged repeat)。這種技術(shù)與SPAR技術(shù)也相近,所用的引物是在copia序列的基礎(chǔ)上設(shè)計的,擴增的是copia序列之間的DNA序列。
(7)IFLP(intron fragment length polymorphism)。檢測的對象是內(nèi)含子的長度差異。根據(jù)內(nèi)含子兩端的特征序列設(shè)計引物,擴增出長度不同的內(nèi)含子片段。
(8)RAMPO(random amplified microsatellite polymorph-ism)。RAMPO的英文全名與RAMP的英文全名相近,但實驗方法卻不同。RAMPO的基本步驟是:先用1個單一的隨機引物(即RAPD引物)對基因組DNA擴增,用電泳將擴增片段分開,然后,把凝膠轉(zhuǎn)移到尼龍膜上,使之與一個帶有放射性標(biāo)記(或其他標(biāo)記)的與SSR互補的寡核苷酸探針如(CA)8和(GA)8雜交,放射自顯影后可得到新的多態(tài)性類型。
先找到RFLP標(biāo)記后,對RFLP探針進行測序,再合成適當(dāng)?shù)腜CR引物,這樣可發(fā)現(xiàn)新的STS標(biāo)記。這也可稱為RFLP-PCR。
3抗性基因同源序列(RGA)
近年來,在各種農(nóng)作物抗性育種的進程和模式生物的抗性研究中,在水稻、玉米、番茄、馬鈴薯、煙草、擬南芥等植物中克隆了若干抗性基因,包括植物對病毒、細菌、線蟲的抗性基因。例如煙草抗花葉病毒基因、水稻抗白葉枯病基因Xa-21、擬南芥抗丁香假單胞桿菌基因RPS2、亞麻抗銹病基因L6以及甘蔗抗胞囊線蟲基因HS1等。
Leister等通過分析研究已克隆的植物抗病基因的結(jié)構(gòu)特征,發(fā)現(xiàn)很大一部分的抗病基因都含有NBS保守序列。同年,《美國科學(xué)院院刊》在同一期發(fā)表了2篇應(yīng)用同源序列從大豆中克隆R基因同源序列的報道,從而引發(fā)了同源序列法在植物抗病基因研究中的應(yīng)用。隨后的大量研究表明,植物抗病基因中存在多種類型的保守結(jié)構(gòu)域。Hammond Kosack和Parker通過分析已克隆的植物抗病基因結(jié)構(gòu),將植物抗病基因分為8 類,其中,含有NBS-LRR(富亮氨酸重復(fù)子Leucine-rich Repeats,LRR)結(jié)構(gòu)域的抗病基因是最主要的類型。
這些結(jié)構(gòu)可能是參與蛋白質(zhì)之間的相互作用或者細胞信號的傳導(dǎo)以及識別。根據(jù)抗性基因的這一共性,以其保守結(jié)構(gòu)的序列為基礎(chǔ)設(shè)計引物,在任何作物中,用PCR技術(shù)擴增和分離具有相似序列的DN段,即抗性基因同源序列。
RGA提供了一種快速鑒定候選抗性基因的便捷途徑。目前已經(jīng)利用此技術(shù)在小麥、大豆、馬鈴薯中鑒定了候選抗性基因,它們在基因組的位置基本上就在已知的抗病基因區(qū)域。已知基因包括抗病毒、細菌、真菌和線蟲的基因。而且部分與抗性基因緊密連鎖的標(biāo)記本身就是抗性基因或者抗性基因的一部分。因此,應(yīng)用RGA進行基因定位可以較快地檢測到與抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記?？梢灶A(yù)見,RGA將成為抗性基因定位的重要手段,并且在分子作圖的領(lǐng)域?qū)l(fā)揮更加巨大的作用[41,42]。
4單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms,SNPs)
單核苷酸多態(tài)性是指2套基因組的DNA序列兩兩進行位置比對時, 單個核苷酸的的不同而顯示出的差異(多態(tài)性)。因此,SNP反映了過去多數(shù)突變事件的特點,2個個體在同一位點攜帶的不同等位基因被認為是進化的遺傳標(biāo)志。顯而易見,SNP是目前已知的多態(tài)性最高的分子標(biāo)記。據(jù)Genbank估計,如果比較2套人類基因組的DNA序列,出現(xiàn)SNP的頻率可達1/2 000~1/1 000,看起來這個頻率并不高,但是考慮到人類基因組共有3.2×109bp時,即可能出現(xiàn)3.2×1012個SNP位點時,這個數(shù)量已經(jīng)相當(dāng)可觀了。并且這只是2套基因組之間的比較,所有的SNP位點肯定比這個數(shù)字大得多。水稻中SNP分布頻率也很高,平均1 000bp就有1個SNP,這些標(biāo)記隨著水稻基因組的實施而被發(fā)現(xiàn)和利用。由于SNP具有同一個位點多態(tài)性低而全基因組多態(tài)性又極其豐富的特點,并且分析時只需要進行陰/陽性分析而不需進行片段的長度分析,特別適合用DNA芯片技術(shù)進行大規(guī)模的掃描分析,是繼微衛(wèi)星后最為高效的標(biāo)記。不過其昂貴的成本(開發(fā)和使用的成本都很高)使其應(yīng)用受到一定的限制。建立可供利用的SNP標(biāo)記需經(jīng)過以下幾步:①全基因組測序;②根據(jù)測序結(jié)果確定特定的序列標(biāo)記位點;③對STS進行掃描,尋找SNP位點;④確定SNP;⑤將SNP定位到染色體上。
5單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Single Strand Conformational Poly-morphism,SSCP)
SSCP是指DNA單鏈構(gòu)象的多態(tài)性,是基于PCR擴增而新發(fā)展起來的一項檢測DNA多態(tài)性的分析技術(shù)。在進行SSCP分析時,利用PCR特異的擴增出基因組目的DN段,然后將這些擴增出來的DN段進行變性處理,使雙鏈DNA分開成單鏈,再用非變性凝膠電泳分離。由于在自然狀態(tài)下,單鏈DNA會折疊卷曲,形成一定點空間構(gòu)象,這種空間構(gòu)象是由DNA鏈的堿基序列決定。如果擴增的目的DN段序列的堿基發(fā)生了變異,就可能造成其單鏈的空間構(gòu)象發(fā)生改變,從而影響其單鏈電泳時的遷移速率,導(dǎo)致其在電泳圖譜上的帶紋位置不同,顯示出不同生物個體DNA的特異性。
6新型分子標(biāo)記的開發(fā)及其應(yīng)用前景
自從20世紀70年代第1代分子(RFLP)標(biāo)記出現(xiàn)以來,分子標(biāo)記家族迅速發(fā)展繁榮起來,并且準(zhǔn)確性和靈敏性也一步步提高。目前的SNP技術(shù)已經(jīng)可以在單個核苷酸的水平上找出不同樣本之間的差異,即使它們之間的親緣關(guān)系非常接近。
縱觀分子標(biāo)記的發(fā)展,是伴隨著人們對生命本質(zhì)的認識一步步加深,認識范圍從宏觀表型一步步逼近微觀世界的進程同步發(fā)展的。任何一個特殊生命現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn),都可能導(dǎo)致革命性的理論或技術(shù)的產(chǎn)生,DNA雙螺旋理論的提出導(dǎo)致了DNA的自我復(fù)制理論,又進而導(dǎo)致了PCR技術(shù)以至于后來的全自動PCR儀的問世(當(dāng)然也少不了其間Taq聚合酶的發(fā)現(xiàn))。比如各種類型的外切酶和內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致了RFLP技術(shù)的產(chǎn)生。
重大的技術(shù)突破來源于理論的突破性進展,重大理論的提出來源于無數(shù)細微現(xiàn)象的總結(jié)?；仡?0世紀生命科學(xué)的重大突破:1900年孟德爾的遺傳理論被重新認識;1920年,摩爾根的基因理論和連鎖遺傳的提出;1953年,DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)理論的提出;直到90年代,自動PCR儀的出現(xiàn)。從此,人們又進入了一個眾多實驗現(xiàn)象的重復(fù)和積累的階段。已經(jīng)有很多不能解釋甚至是矛盾的試驗現(xiàn)象在陸續(xù)出現(xiàn)?？梢灶A(yù)言,下一次的理論突破將導(dǎo)致更加革命性的發(fā)現(xiàn),也必將使得分子標(biāo)記技術(shù)能夠從更加深的層面上解釋生命現(xiàn)象本身,人們對分子標(biāo)記的認識和利用也更加深刻和簡便。并且隨著計算機技術(shù)的迅速發(fā)展,使得人們不僅能從浩如煙海的數(shù)據(jù)和現(xiàn)象中發(fā)現(xiàn)總結(jié)規(guī)律,還能夠根據(jù)現(xiàn)有的現(xiàn)象和規(guī)律來預(yù)測可能的現(xiàn)象乃至規(guī)律。根據(jù)目前的發(fā)展來看,分子標(biāo)記的用途不會再局限在傳統(tǒng)的生物、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域,還會擴大到諸如數(shù)據(jù)加密傳輸、計算技術(shù)等領(lǐng)域。
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論文關(guān)鍵詞:分子標(biāo)記,蘋果,應(yīng)用
1DNA分子標(biāo)記技術(shù)
隨著人類對基因從現(xiàn)象到本質(zhì)的認識,遺傳標(biāo)記逐步從形態(tài)標(biāo)記、細胞學(xué)標(biāo)記和生化標(biāo)記發(fā)展到能直接反應(yīng)DNA水平上遺傳多態(tài)性的DNA分子標(biāo)記。與經(jīng)典的遺傳標(biāo)記相比較,DNA分子標(biāo)記具有不受材料來源和環(huán)境的限制,遺傳穩(wěn)定、多態(tài)性高、標(biāo)記位點多、共顯性、選擇中性、重復(fù)性好、檢測迅速、操作簡便等優(yōu)勢,所以DNA分子標(biāo)記被視為理想的遺傳標(biāo)記技術(shù),而且迅速得到發(fā)展。目前,已有20多種分子標(biāo)記技術(shù)被發(fā)展和利用?；贒NA多態(tài)性的分子標(biāo)記技術(shù)主要可以分為三類:第一類以傳統(tǒng)的Southern雜交為基礎(chǔ),RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism)為代表;第二類以PCR技術(shù)為基礎(chǔ),RAPD(RandomlyAmplifiedPolymorphicDNA)、STS(SequenCETaggedSite)、SCAR(SequenceCharacterizedAmplifiedRegion)和AFLP(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism)為代表;第三類以重復(fù)序列為基礎(chǔ),SSR(SmipleSequenceRepeat)為代表。
隨著分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、生物化學(xué)等學(xué)科理論研究的不斷深入和實踐應(yīng)用的不斷成功,DNA分子標(biāo)記技術(shù)已被廣泛的應(yīng)用于遺傳育種、種質(zhì)資源鑒定、植物抗病基因定位、植物分類等諸多研究領(lǐng)域。經(jīng)常應(yīng)用于果樹研究的DNA分子標(biāo)記有RFLP、RAPD、AFLP、SSR和SCAR等。
2DNA分子標(biāo)記技術(shù)在蘋果研究中應(yīng)用
2.1品種的鑒定
蘋果是多年生木本植物,栽培歷史悠久,不同地域間的種質(zhì)交流頻繁,導(dǎo)致種質(zhì)混亂,同名異種現(xiàn)象普遍。傳統(tǒng)的形態(tài)和同工酶分析方法誤差大、效率低,難于對相似的品種進行準(zhǔn)確的鑒定。DNA分子標(biāo)記技術(shù)直接從DNA分子水平上對果樹品種(系)進行鑒定和分類,準(zhǔn)確性更強,效率更高,信息量更大,近幾年已得到廣泛應(yīng)用。
Koller等用引物P2(5’ACGAGGGACT3’)成功地區(qū)分了11個蘋果品種。Tancred等將澳大利亞選育的特早熟品種GB-63-43與其余3個相似品種區(qū)分開。祝軍等應(yīng)利用AFLP技術(shù)區(qū)分了25個蘋果品種,用RAPD技術(shù)區(qū)分了16個蘋果品種。周愛琴等用RAPD分析繪制了19個蘋果生產(chǎn)上主要砧木的DNA指紋圖譜,為蘋果砧木的鑒定提供了新的依據(jù)。
2.2親緣關(guān)系的確定
蘋果中存在許多天然雜種,對一些經(jīng)實生選種或采用混合花粉雜交選育的品種的親本無法確定,在品種DNA指紋圖譜建立的基礎(chǔ)上對其進行聚類分析,可將品種進行分類以鑒定物種起源的親緣關(guān)系。蘋果品種津輕是日本1936年以金冠為母本雜交育成,經(jīng)RAPD結(jié)合RFLP分析確認其父本為紅玉。喬納金和陸奧是兩個三倍體品種,是金冠分別與紅玉、印度雜交而成,RAPD分析表明二者都含有金冠的2n配子。王濤等利用AFLP分析了20個重要蘋果砧木間的親緣關(guān)系,聚類分析表明蘋果屬(MalusMill.)中的兩個亞屬的砧木被分別聚成兩個大組,即花楸蘋果亞屬(SorbomalusZabel)大組和真蘋果亞屬(Eu-malusZabel)大組。
2.3種質(zhì)資源的保存
果樹種質(zhì)資源是為生產(chǎn)提供優(yōu)良品種的源泉,是果樹育種和品種改良的物質(zhì)基礎(chǔ),因此果樹種質(zhì)資源是人類的寶貴財富。遺傳資源的長期保存需要消耗巨大的人力物力,核心種質(zhì)(corecollection)的概念就是為了盡可能降低消耗而被提出的,利用核心種質(zhì)理論來長期保存種質(zhì)資源是提高種質(zhì)資源管理質(zhì)量和效率的重要途徑,它不但要求對種質(zhì)的農(nóng)藝性狀進行研究,還要研究它們的遺傳變異,以避免重復(fù)、減少缺失。Mcferson認為分子標(biāo)記可以用于核心種質(zhì)的確定。HokansonS.C.等用SSR結(jié)合園藝性狀建立了蘋果的核心種質(zhì)。
2.4遺傳多樣性的檢測
遺傳多樣性一般是指種內(nèi)的差異水平,它反映著一個物種適應(yīng)環(huán)境的能力及其被改造和利用的潛力。遺傳多樣性是生命系統(tǒng)的基本特征,也是物種適應(yīng)自然和發(fā)生進化的遺傳基礎(chǔ)。分子標(biāo)記產(chǎn)物的多態(tài)性反映了被測材料的多樣性。分子標(biāo)記是檢測種質(zhì)資源遺傳多樣性的有效工具。張開春等用38個隨機引物進行RAPD分析,在DNA水平上說明了我國的蘋果無融合生殖資源平邑甜茶(Malushupehensis)具有豐富的遺傳多樣性。
關(guān)鍵詞：臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)學(xué)生；生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗課；轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)
中圖分類號：G642.0 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1674-9324（2015）30-0064-02
隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床醫(yī)學(xué)之間的關(guān)注焦點與研究方法差距越來越大，溝通和交流卻逐漸減少，最終產(chǎn)生了二者之間的鴻溝，被稱之為“基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床醫(yī)學(xué)之間的死亡谷”[1]。轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)（translational medicine）又稱為轉(zhuǎn)化研究（translational research）。1992年，Choi[2]在《Science》上發(fā)表的論文中首次提出了“bench to bedside”的概念；1996年，Geraghty[3]在《Lancet》上發(fā)表文章首次應(yīng)用“translational medicine”一詞；2003年，Zerhouni[4]在《Science》上發(fā)表的文章“Medicine. The NIH Roadmap”中提出了轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的概念，其核心內(nèi)容是將醫(yī)學(xué)生物學(xué)基礎(chǔ)研究成果迅速、有效地轉(zhuǎn)化為可在臨床實際中應(yīng)用的理論、技術(shù)、方法和藥物，在實驗室與病房（bench to bedside）之間架起相互溝通的橋梁。不論是基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)還是臨床醫(yī)學(xué)課程，實驗教學(xué)都是臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)學(xué)生教學(xué)中的重要環(huán)節(jié)，只有通過實際的操作和操作中獲得的對理論知識的二次習(xí)得，才能使臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)學(xué)生對復(fù)雜抽象的理論知識理解得更加透徹，在實驗課中學(xué)生的基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)技能操作也得到很好的鍛煉。生物化學(xué)與分子生物學(xué)是臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)學(xué)生所學(xué)習(xí)的一門重要的基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)課程，它連接著基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)。在生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗教學(xué)中創(chuàng)新性地結(jié)合轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)理念和內(nèi)容，使學(xué)生在掌握生物化學(xué)與分子生物學(xué)基礎(chǔ)知識，培養(yǎng)科學(xué)思維能力的同時，兼具有轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)理念和思維模式的復(fù)合型人才的培養(yǎng)，這是生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗教學(xué)的一項創(chuàng)新，并影響了實驗課內(nèi)容、方式和教學(xué)方法的選擇。
一、生物化學(xué)與分子生物學(xué)的學(xué)科特點
生物化學(xué)與分子生物學(xué)是生命科學(xué)的基礎(chǔ)，是在分子水平探討生命的本質(zhì)，主要包括研究生物體的分子結(jié)構(gòu)與功能、物質(zhì)代謝與調(diào)節(jié)，以基因信息傳遞為中心的現(xiàn)代分子生物學(xué)知識。生物化學(xué)與分子生物學(xué)的主要內(nèi)容決定了其知識點紛繁復(fù)雜，使得學(xué)生學(xué)習(xí)起來枯燥吃力，因此在理論或?qū)嶒灲虒W(xué)過程中，應(yīng)建立“病例引導(dǎo)型教學(xué)”[5]（Case Based Study，CBS），從具體臨床疾病現(xiàn)象做引入使學(xué)生先有具體模像，然后對疾病相關(guān)的生化和分子生物學(xué)機理進行分析和講解，這樣“由表及里”地引導(dǎo)教學(xué)過程能讓學(xué)生有層次地學(xué)習(xí)和理解生化與分子生物學(xué)知識，課堂中營造出的“病例-機理”氛圍也能使醫(yī)學(xué)生感受到生物化學(xué)與分子生物學(xué)在臨床中的重要性。生物化學(xué)與分子生物學(xué)又是生命科學(xué)領(lǐng)域的前沿學(xué)科，新理論、技術(shù)層出不窮，具有很強的更新及前瞻性。與日新月異的發(fā)展前沿不同，教學(xué)所采用的教科書的更新和修訂速度較慢，因此不論在理論或?qū)嶒灲虒W(xué)中，教師都應(yīng)主動在教學(xué)過程中添加前沿新發(fā)現(xiàn)和技術(shù)，這樣不僅能引起學(xué)生學(xué)習(xí)的積極性，更能拓寬學(xué)生的知識面和對基礎(chǔ)知識的理解和掌握。生物化學(xué)與分子生物學(xué)已滲透到基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的各個領(lǐng)域，對于醫(yī)學(xué)生來說學(xué)好生物化學(xué)與分子生物學(xué)十分必要，可為后續(xù)基礎(chǔ)與專業(yè)課程的學(xué)習(xí)奠定基礎(chǔ)。
二、生物化學(xué)與分子生物學(xué)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的聯(lián)系
醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)是基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床醫(yī)學(xué)的橋梁。作為基因組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)時展產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)，其研究內(nèi)容的中心環(huán)節(jié)之一是生物標(biāo)志物的研究，涉及到分子標(biāo)志物的鑒定和作用；基于分子分型的個體化用藥治療，疾病治療反應(yīng)和預(yù)后的評估與預(yù)測[6]。轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的主要任務(wù)是架起基礎(chǔ)科研工作者跟臨床醫(yī)師的橋梁。它的出現(xiàn)使得基礎(chǔ)科學(xué)重視臨床醫(yī)學(xué)中遇到的現(xiàn)象和問題，并根據(jù)現(xiàn)象追根溯源尋找機理原因，并能將研究出的機理成果運用到臨床問題中，解決臨床醫(yī)學(xué)現(xiàn)實中遇到的困難。并在“現(xiàn)象-機理-運用”這一過程中形成及時反饋，使臨床研究者修改觀察指標(biāo)或側(cè)重點，同時也相應(yīng)地使基礎(chǔ)研究者修改研究方向，為臨床服務(wù)，最終使患者受益。其兩者都是橋梁學(xué)科，與多學(xué)科密切聯(lián)系，特別是與臨床知識密切相關(guān)。這就要求醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)工作者教學(xué)與研究必須以轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的理念為指導(dǎo)，從而適應(yīng)轉(zhuǎn)化型醫(yī)學(xué)人才培養(yǎng)的要求。
三、生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗課與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)理念的創(chuàng)新結(jié)合
1.引入病例引導(dǎo)型實驗內(nèi)容。在實驗教學(xué)中，建立“病例引導(dǎo)型教學(xué)”（CBS）內(nèi)容。用具體臨床疾病做實驗背景，并闡述疾病相關(guān)的生化和分子生物學(xué)原理，然后對驗證此原理所采用的實驗技術(shù)進行講解和操作示范，學(xué)生即可開始實驗操作并完成報告和教師布置的相應(yīng)思考題。例如，我們使用醫(yī)院生化化驗單的幻燈片來引入血糖這一生化指標(biāo)，講述血糖的生化和臨床診斷意義，并以糖尿病為病例講解血糖超標(biāo)后對身體的影響，在進行背景鋪墊后開始講解葡萄糖氧化酶測定血糖的原理及方法，最后讓學(xué)生對事先準(zhǔn)備好的不同血糖濃度的血漿樣本進行檢測，獲得結(jié)果后進行分析：所測樣本血糖是否在正常；如果不在正常值范圍內(nèi)，是偏低還是偏高，分別可能的原因是什么。經(jīng)過這次實驗，學(xué)生不僅學(xué)習(xí)了檢測血糖原理的實驗技術(shù)，并對血糖的生化知識和臨床運用有了很好的結(jié)合學(xué)習(xí)。
2.引入個性化用藥治療的系統(tǒng)實驗內(nèi)容。轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)將分子標(biāo)志物、分子分型的個體化用藥治療及疾病治療與預(yù)后的評估與預(yù)測作為最主要的研究內(nèi)容。在實驗中充分融入轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)科研成果，開展一系列以科研成果如個體化用藥治療為主的內(nèi)容新穎、應(yīng)用性強的專業(yè)前沿研究性實驗，能夠極大地調(diào)動和培養(yǎng)學(xué)生的專業(yè)學(xué)習(xí)興趣，使學(xué)生對目前科學(xué)研究領(lǐng)域的熱點與關(guān)鍵問題有初步的了解，較好地實現(xiàn)科研與教學(xué)的相互轉(zhuǎn)換，相互促進。我們在實驗課中創(chuàng)新設(shè)置了“限制性片段長度多態(tài)性檢測人乙醛脫氫酶2（ALDH2）基因多態(tài)性”實驗。首先為學(xué)生講解整個實驗背景：硝酸甘油作為治療心絞痛的基本藥物之一廣泛用于臨床。研究發(fā)現(xiàn)硝酸甘油的舒血管作用通過釋放一氧化氮（NO）所介導(dǎo)[7]。乙醛脫氫酶2（ALDH2）具有硝酸酯酶活性，對硝酸甘油轉(zhuǎn)化產(chǎn)生NO起了關(guān)鍵作用[8]，而ALDH2基因中Glu504Lys位點的多態(tài)性會影響ALDH2硝酸酯酶活性，用藥指導(dǎo)建議，ALDH2 504Lys等位基因攜帶患者慎用硝酸甘油[9]，所以這一基因多態(tài)性位點具有指導(dǎo)臨床硝酸甘油的合理用藥的重要意義。然后為學(xué)生講解人脫氧核糖核酸（DNA）的提取、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)和瓊脂糖凝膠電泳檢測這些關(guān)鍵技術(shù)的原理和方法。使得學(xué)生對實驗背景、目的和所采用技術(shù)的原理及操作都能有統(tǒng)一清晰的認識。具體實驗流程為指導(dǎo)學(xué)生從自己的口腔黏膜細胞中提取自己的DNA，經(jīng)過PCR特異性地擴增ALDH2基因中含Glu504Lys片段，再經(jīng)過酶切反應(yīng)和電泳檢測即可獲得自己的Glu504Lys位點基因型。通過這一系列綜合開放性的實驗，以學(xué)生自身遺傳多態(tài)性為背景，將臨床個性化用藥檢測與經(jīng)典的分子生物學(xué)實驗結(jié)合，不僅極大地激發(fā)了學(xué)生對實驗的關(guān)注和投入，訓(xùn)練了實驗操作能力，還加強了他們轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)思維的培養(yǎng)，
3.實驗教材的采編。實驗教材是實驗課程的重點。本教研室認真研究國內(nèi)外優(yōu)秀教材，借鑒其經(jīng)驗，同時結(jié)合本學(xué)院學(xué)生的臨床需求，精心編寫自己的教材，建設(shè)與生物化學(xué)與分子生物學(xué)基礎(chǔ)課程配套的實驗系列教材。同時也精心挑選合適的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)內(nèi)容穿插入實驗教學(xué)過程中。
隨著日新月異的生化和分子生物學(xué)進展，我們也對前沿進展和發(fā)現(xiàn)保持持續(xù)關(guān)注，將更新的內(nèi)容及時修改、添加到實驗教材中。
以上僅是我們作為生物化學(xué)與分子生物學(xué)教師在轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)大背景下，在教學(xué)改革方面的一些探索的心得及體會，隨著轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的發(fā)展，其內(nèi)容必將會更新和擴大，作為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教師要敏銳地跟上發(fā)展腳步，積極尋找轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)與生化、分子生物學(xué)的結(jié)合點，才能為國家培養(yǎng)出基礎(chǔ)扎實、科研思維清晰的有用醫(yī)學(xué)之才。
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一、野生型雌激素受體結(jié)構(gòu)和功能
ER基因定位于q24和q27之間的第6對染色體的短臂上，由8個外顯子組成。野生型ER蛋白的相對分子質(zhì)量大約為 65 000，與雌二醇具有很高的親和性［1］。ER屬于配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子的大家族，后者包括其他的類固醇激素受體、甲狀腺激素受體、視黃酸受體、維生素D受體和大量尚未明確配體的所謂“孤立受體”。用A～F 6個字母分別代表這些受體序列排列中的6個區(qū)域。E 區(qū)主要組成了配體結(jié)合區(qū)，該區(qū)包括外顯子4到8和裝配配體結(jié)合的一個疏水區(qū)。DNA結(jié)合區(qū)包括二個鋅指結(jié)構(gòu)，使其能夠與上游雌激素依賴基因啟動區(qū)的特異性雌激素反應(yīng)元件或單元（HRE）相協(xié)調(diào)［2，3］，外顯子2和3編碼該區(qū)域，具有激活功能的為AF1和AF2兩個轉(zhuǎn)錄區(qū)。AF1包括A、B區(qū)的大部分，核受體含有兩個轉(zhuǎn)錄激活功能（AF）區(qū)，分布位于受體C端的激素結(jié)合區(qū)（AF2）和N端區(qū)（AF1），AF2為激素依賴性，而AF1是激素非依賴的。AF2還是核受體與其他轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)因子（共激活因子或共抑制因子等）相互作用的部位。甾體激素受體的每個AF均具有明顯的細胞特異性特點，即使對于某一特定的靶基因而言，靶基因啟動子的組成特性也能影響AF（特別是AF2）的轉(zhuǎn)錄活性。D區(qū)包括核的定位信號，即所謂的“橋接區(qū)”，它并不依賴于配體結(jié)合。
當(dāng)激素進入細胞后，與受體結(jié)合為復(fù)合物。激素-受體復(fù)合物活化需要一定的溫度，至于激素與受體的結(jié)合在胞質(zhì)還是在核內(nèi)尚有爭論?；罨膹?fù)合物與DNA結(jié)合，這種結(jié)合具有選擇性，與DNA順序有關(guān)。這一結(jié)合部分稱為HRE.HRE可能由不連續(xù)的若干單元組成，其位置不論是在所調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄起始單元的3＇-末端還是5＇-末端方向都有作用。根據(jù)這些表現(xiàn)，可以認為HRE屬于調(diào)節(jié)基因中的增強子。激素特異性在于細胞內(nèi)的特異受體。由于激素－受體復(fù)合物與HRE結(jié)合，引起DNA構(gòu)象改變，活化了附近的啟動子，從而促使轉(zhuǎn)錄。當(dāng)受體活性化或轉(zhuǎn)化后，其產(chǎn)物作用于染色質(zhì)的特殊部位，并通過各種酶和激活的RNA聚合酶的活性促進核酸的迅速復(fù)制，轉(zhuǎn)錄特殊基因信息而合成特殊蛋白質(zhì)。減弱染色體DNA－ 組蛋白的結(jié)合，激活基因而增強其模板活性，進而促進RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的合成。
ER與它的同源配體（主要為雌二醇）結(jié)合后引起一系列的受體激活步驟：包括受體與熱休克結(jié)合蛋白的脫離，大量絲氨酸和酪氨酸殘基以及二聚體的磷酸化。激活的受體復(fù)合物與HRE序列的回文結(jié)構(gòu)相結(jié)合，隨后通過ER的AF1和AF2區(qū)與其他的轉(zhuǎn)錄成分的蛋白－蛋白結(jié)構(gòu)形成激活轉(zhuǎn)錄過程。缺乏配體結(jié)合區(qū)的重組缺失突變能夠與 HRE 相結(jié)合而激活其轉(zhuǎn)錄，這表明了AF1的基本活性，不過此活性水平比激活的野生型受體要低得多。相比較而言，AF2需要配體的存在來獲得轉(zhuǎn)錄活性，但其活性程度取決于結(jié)合配體的性質(zhì)［4-6］。由于DNA－AF1結(jié)合引起興奮作用，而三苯氧胺能拮抗雌激素對AF2的作用，三苯氧胺和類似化合物的混合興奮活性可能部分是由于導(dǎo)致了ER的二聚化作用［7］。 有證據(jù)表明，不同的激活劑和輔阻遏劑可明顯地影響諸如三苯氧胺的混合興奮劑的反應(yīng)水平［8，9］。這種復(fù)雜的雌激素信號分子途徑表明ER的突變和變異在不同組織之間有很大不同，也較難預(yù)言。
二、雌激素受體基因的突變
這里的突變概念是指ER基因的DNA序列發(fā)生了變化，而變異是指在mRNA或蛋白水平上發(fā)生的異常改變，并不涉及DNA的編碼異常。這樣的受體除本身功能降低或喪失外， 還有可能與正常受體競爭配體、DNA上的結(jié)合部位及轉(zhuǎn)錄因子等，從而使細胞對相應(yīng)激素不產(chǎn)生反應(yīng)。此外，由于三苯氧胺是借助于與雌激素競爭結(jié)合受體發(fā)揮作用，所以，也就導(dǎo)致這樣的乳腺癌對三苯氧胺的治療不敏感。實驗發(fā)現(xiàn)完全性的功能性ER基因丟失會導(dǎo)致雌性鼠的導(dǎo)管發(fā)育不全［10］。Mahfoudi等［11］發(fā)現(xiàn)在鼠的ER基因538和552位點之間發(fā)生的點突變能降低其雌激素依賴性轉(zhuǎn)錄活性，但并不明顯影響激素或DNA的結(jié)合。然而，這些突變卻能戲劇性地改變雌激素拮抗劑的藥物學(xué)效應(yīng)；在表達這些突變的Hela細胞中，三苯氧胺和純類固醇性抗雌激素ICI164384都變成了強烈的興奮劑。也有人在Leu540Gln突變中發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象。由于這樣突變的受體一方面喪失了對其配體的正常生理性結(jié)合，另一方面，通過受體非配體依賴性激活的方式，可能就起到了類似促細胞分裂增殖的病理生物學(xué)效應(yīng)，因此這樣所謂的“陽性”ER實際上缺乏了它原有的生物學(xué)作用，從而降低或喪失了對激素即雌激素的反應(yīng)性。但除了顯示對抗雌激素藥物的興奮反應(yīng)外，這種突變也同時顯示對雌二醇的拮抗作用。這種AF2突變現(xiàn)象在理論上可以解釋某些乳腺癌對三苯氧胺治療不敏感的原因［12］。
Wolf和Jordan ［13］報道了一個MCF－7人乳腺癌的異種移植體，這是對三苯氧胺已經(jīng)獲得了抵抗、卻能在三苯氧胺的刺激下進行生長。結(jié)果發(fā)現(xiàn)它含有在ER配體結(jié)合區(qū)域的突變，是由于基因351位點上的天門冬氨酸被酪氨酸所替代。進一步研究發(fā)現(xiàn)，用突變的ER轉(zhuǎn)染的MDA－MB－231細胞對三苯氧胺的反應(yīng)與對雌激素的反應(yīng)相似。因此，自發(fā)性的或?qū)嶒炐缘腅R突變均表明這些畸變會影響乳腺癌對內(nèi)分泌治療的敏感程度。Karnik等［14］研究了143 例家族性乳腺癌或卵巢癌病人的ER突變情況，利用SSCP－PCR等方法發(fā)現(xiàn)其中3例有在AF1的Gly160Cys 干系替換。這種現(xiàn)象也發(fā)生在對照組白細胞DNA中，表明這可能反映了它的多態(tài)性，只有5個在外顯子 1、3～5和8的第三對堿基的替換發(fā)生，但也被認為是多態(tài)性緣故，因為這種情況與腫瘤的激素受體或與三苯氧胺的抵抗?fàn)顩r無關(guān)，也未伴隨有保守的體細胞系突變。
Roodi等［15］調(diào)查了118例ER陽性和70例ER陰性癌中的ER突變情況，發(fā)現(xiàn)了2例錯義突變，5例多態(tài)性被檢測出，但沒有1例與臨床病理學(xué)特征有關(guān)?？傊?，以上這些研究所發(fā)現(xiàn)的突變僅占極少部分。與這些結(jié)果不同的是，在 30％以上的乳腺增生過長和其相應(yīng)的正常組織中檢測到有 ER突變，但在未發(fā)生病變的正常乳腺組織中未發(fā)現(xiàn)有突變。位于外顯子4上的賴氨酸替換成精氨酸的突變會引起MCF－7細胞對雌二醇的增殖反應(yīng)性增加200倍以上，但這種現(xiàn)象是發(fā)生在乳腺良性增生性疾病中，至于在乳腺癌中的類似突變尚未見報道。因此，這樣低的ER突變頻率是難以解釋乳腺癌對激素抵抗的現(xiàn)象，至少也不可能對常規(guī)的臨床檢測病例中作出能足以說明問題的解釋。
三、雌激素受體基因的的變異
有大量的乳腺癌ERmRNA變異型報道，在正常乳腺組織和其他器官中也有發(fā)現(xiàn)。較多的主要是橋接變異，發(fā)生ERmRNA 的1個或幾個外顯子缺失，其他的有隱蔽的橋接變異，發(fā)生了新的架接連接，以及外顯子的復(fù)制，或轉(zhuǎn)錄中有非ER性的序列產(chǎn)生。這些結(jié)果主要導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄信息的丟失，翻譯紊亂，或者引起轉(zhuǎn)錄蛋白結(jié)構(gòu)的不完整，原因是非ER序列中出現(xiàn)的終止轉(zhuǎn)錄編碼。目前研究較多的是外顯子5的變異情況。用它的變異現(xiàn)象來解釋ER-/孕激素（PR）+乳腺癌的存在，因為PR的表達是高度依賴于雌激素源性的信號。Fuqua等［16］發(fā)現(xiàn)4例 ER-/PR+乳腺癌中有3例的外顯子5mRNA水平比野生型ERmRNA要高得多。相對而言，在5例ER/PR均陽性的腫瘤中，其結(jié)果卻相反。盡管這種是外顯子5 缺乏的變異，但這足以引起翻譯后蛋白序列結(jié)構(gòu)的改變，引起蛋白長度被截短，相對分子質(zhì)量也只有40 000，缺乏配體結(jié)合區(qū)域。當(dāng)這種變異轉(zhuǎn)染到MDA－MB－231乳腺癌細胞后，它能激活 HRE 接近60％ 野生型受體的效率，它并不依賴于雌激素配體，也不受雌激素拮抗劑的影響。重要的是，從ER陰性，PR弱陽性的BT20乳腺癌細胞中已抽提出了外顯子5蛋白，這是在非轉(zhuǎn)染細胞的蛋白水平上缺失變異的唯一證據(jù)。
另一個實驗是用外顯子5變異轉(zhuǎn)染的MCF－7細胞，其生長速度比用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的對照組要快得多，而且PR水平也高于野生型的細胞［17］，而且它可抵抗4－羥基三苯氧胺的處理，其原因可能是這種變異能夠與野生型受體形成二聚體從而不受三苯氧胺的調(diào)節(jié)作用。臨床的資料也進一步佐證，在 ER－/PR+ 或 ER－及其他的雌激素依賴蛋白（如pS2）的腫瘤中，發(fā)現(xiàn)有較高頻率的變異情況，因而認為這種變異對PR和pS2表達有活性作用。也有報道外顯子的丟失會引起受體功能喪失。Dotzlaw 等［18］發(fā)現(xiàn)了外顯子2或3截短的變異，當(dāng)將其共同轉(zhuǎn)染到COS－1細胞后，未見有轉(zhuǎn)錄發(fā)生，所以即使DNA結(jié)合區(qū)域完好，但當(dāng)有ER基因的截短變異發(fā)生時，將導(dǎo)致無功能性受體的產(chǎn)生。有人在子宮絨毛膜上皮癌和胚胎癌中也發(fā)現(xiàn)了類似情況，外顯子7的丟失變異也可使轉(zhuǎn)錄過程丟失，當(dāng)在酵母表達載體系統(tǒng)中表達時可抑制其野生型ER的轉(zhuǎn)錄活性［19］。由于在幾乎一半的ER+/PR－的腫瘤中發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象，說明這種變異可能主要出現(xiàn)在ER功能陰性的腫瘤中，導(dǎo)致所謂ER+的腫瘤對雌激素的反應(yīng)性降低。由此可見，通過腫瘤的ER變異情況可聯(lián)系其預(yù)后狀況，不過這需要豐富的臨床資料來證實。
由于所發(fā)現(xiàn)的ER變異均是在mRNA水平上，缺乏相應(yīng)蛋白水平上的證據(jù)，有人懷疑這與是否用極其敏感的RT－PCR導(dǎo)致的實驗假象有關(guān)，認為這是ER基因轉(zhuǎn)錄中的正常過程。但事實上，目前所發(fā)現(xiàn)的這些變異是具有組織特異性的，而且其受體超家族的其余成員沒發(fā)生變異。
總之，對于實驗中發(fā)現(xiàn)的ER點突變可能對其蛋白功能有明顯的影響，但就聯(lián)系臨床上乳腺癌的發(fā)展和其表現(xiàn)型來看，至少目前的證據(jù)還很難證實。而ER的變異主要是在mRNA水平上，鑒于缺乏相應(yīng)蛋白水平的依據(jù)，對于這種變異的臨床意義還值得進一步探討。
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在高校遺傳學(xué)教學(xué)中存在許多經(jīng)典案例，如：果蠅的翅型、體色、眼色等性狀的遺傳；豌豆的性狀遺傳以及玉米籽粒的形狀和顏色性狀的遺傳等。其中，還有一個非常重要的經(jīng)典案例，即血型遺傳。自20世紀初至今,ABO血型遺傳一直是復(fù)等位基因的一個不可缺少的經(jīng)典案例。隨著科學(xué)技術(shù)的高速發(fā)展，血型的經(jīng)典內(nèi)涵得到不斷提升，新的研究結(jié)果使血型遺傳所涵蓋的遺傳學(xué)知識點越來越多，內(nèi)容越來越豐富。因此，以我們身邊最常見的表型--血型為案例開展遺傳學(xué)教學(xué)不僅可以將復(fù)雜的知識點簡單化、形象化，便于理解，還可以將繁多的基礎(chǔ)知識串聯(lián)起來，便于記憶。另外，以血型遺傳作為經(jīng)典案例在遺傳學(xué)的教學(xué)中還可以不斷加人新的研究和新的應(yīng)用，使經(jīng)典的內(nèi)涵不斷得到新的提升，讓學(xué)生的視野接觸到前沿的科學(xué)知識，為日后的科研接力打好基礎(chǔ)。
1血型與遺傳學(xué)之間的重要關(guān)系
開展案例教學(xué)，案例的選擇是關(guān)鍵。血型是人類血液由遺傳控制的個體性狀之一，與人類的生活關(guān)系密切，用途廣泛。自1900年到2005年，已檢測出約29個血型系統(tǒng)[21。臨床上最常用的有“ABO血型系統(tǒng)”、“Rh血型系統(tǒng)”、“MN血型系統(tǒng)”和“HLA血型系統(tǒng)”。這些血型系統(tǒng)涵蓋了復(fù)等位基因、基因互作之上位效應(yīng)等遺傳學(xué)的孟德爾定律拓展原理，基因的表達調(diào)控及群體遺傳等遺傳學(xué)的精髓內(nèi)容。透過這個知識窗口，可以看到遺傳學(xué)在血型中的奧秘。
孟德爾遺傳定律從建立、發(fā)展到不斷拓展完善，一直都是貫穿高校遺傳學(xué)教學(xué)的核心知識點。由于現(xiàn)在大學(xué)生從高中開始就接觸孟德爾定律，如果大學(xué)教學(xué)還是重復(fù)高中階段所涉及的內(nèi)容，學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣難以提高。在高中知識的基礎(chǔ)上，開展案例教學(xué)，引入現(xiàn)代遺傳學(xué)在人類血型上的最新認識，則不但可以給學(xué)生一種似曾相識的感覺，還能自然地激起他們深入探索的興趣。血型的遺傳特征及生化基礎(chǔ)可以清晰明了地向?qū)W生闡述清楚孟德爾定律的一些重要的延伸知識內(nèi)容。從紅細胞血型到白細胞血型，從常見的ABO血型到罕見的孟買、Rh血型，對于假基因、等位基因、復(fù)等位基因和擬等位基因等不容易理解的基因概念以及基因之間的相互作用都可以通過血型案例，把學(xué)生帶入情境之中，在教師的指引下由學(xué)生自己依靠其擁有的基礎(chǔ)知識結(jié)構(gòu)和背景，在血型案例情境中發(fā)現(xiàn)、分析和解決問題，比較輕松地掌握這些容易混淆不清的概念和一些難以理解的遺傳學(xué)現(xiàn)象，如非等位基因之間的相互作用之上位效應(yīng)等。
此外，人的血紅蛋白基因在不同發(fā)育時期的表達調(diào)控還涉及遺傳學(xué)中的表型和基因型之間的關(guān)系，真核生物中的基因表達調(diào)控模式等知識點。對血型相關(guān)的一些遺傳疾病進行分析，還可以引申出基因突變和染色體缺失突變及一些重要的遺傳標(biāo)記。血型的遺傳學(xué)檢測方法及臨床上的輸血原則和溶血、血型互配等現(xiàn)象也與受基因表達調(diào)控的紅細胞的細胞膜糖基的特征和生化機制密切 相關(guān)，引導(dǎo)遺傳學(xué)從理論到實驗，再到實踐中的應(yīng)用。血型與疾病的關(guān)聯(lián)分析，把科研思維引入高校遺傳學(xué)教學(xué)中，讓學(xué)生緊跟時展的步伐，理論聯(lián)系實際，為日后的科研工作打好基礎(chǔ)。
遺傳學(xué)中兩大重要的主題是遺傳和變異，主要包括孟德爾遺傳和連鎖遺傳、基因突變和染色體畸變。通過以復(fù)旦大學(xué)遺傳學(xué)教學(xué)大綱為參考，與劉祖洞主編的《遺傳學(xué)》和喬守怡主編的《現(xiàn)代遺傳學(xué)》教材內(nèi)容相比較發(fā)現(xiàn)，血型遺傳案例除了與上述遺傳學(xué)四大內(nèi)容關(guān)聯(lián)外，還涉及到基因的表達調(diào)控、群體遺傳、表觀遺傳等知識點，其中大部分知識點都是要求學(xué)生重點掌握的內(nèi)容。目前，血型案例所涵蓋的主要遺傳學(xué)知識內(nèi)容及在遺傳學(xué)學(xué)科中的重要意義的歸納見表1。因此，把血型作為經(jīng)典案例，開展遺傳學(xué)的案例教學(xué)既貼近生活，引發(fā)學(xué)生深刻的思考，又能代表性地進一步闡述探討遺傳學(xué)的生物知識。
2血型案例在遺傳學(xué)教學(xué)中的開展
在以血型為案例的教學(xué)過程中，我們首先根據(jù)高校遺傳學(xué)的教學(xué)目標(biāo)和培養(yǎng)目標(biāo)的要求，在學(xué)生掌握了一些遺傳學(xué)的基礎(chǔ)知識和理論知識的基礎(chǔ)上，結(jié)合遺傳學(xué)的教學(xué)進度逐步有序地進行介紹：1.血型基本知識介紹；2.紅細胞血型的細胞膜糖基特征和生化機制；3.紅細胞血型與輸血；4.血型的遺傳學(xué)規(guī)律特征，包括(I)ABO血型復(fù)等位基因遺傳及其應(yīng)用，（II)ABO血型基因的克隆，（III)ABO血型的遺傳學(xué)鑒定；5.ABO血型的拓展，包括(I)孟買血型與擬孟買血型，（II)紅細胞血型與白細胞血型。下面主表1血型與高校遺傳學(xué)教學(xué)的重要關(guān)系
要選取兩個方面闡述在遺傳學(xué)教學(xué)中的開展過程。
2.1血型基本知識在教學(xué)中的開展
ABO血型系統(tǒng)是第一個被描述的紅細胞血型系統(tǒng)，也是最具有臨床意義的一個系統(tǒng)。因此，在進行血型基本知識介紹時往往以ABO血型為例。隨著以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的血型研究的發(fā)展，ABO血型的基因遺傳背景目前已比較清楚。在介紹血型基因的基本知識同時也涵蓋著遺傳學(xué)知識的傳播，而且隨著血型基因知識的不斷豐富完善，涵蓋的遺傳學(xué)知識也越來越廣泛。
ABO血型由3個復(fù)等位基因控制，即iA、產(chǎn)和i°o在開展遺傳學(xué)相關(guān)教學(xué)活動時，一般都用此作為分析生物界中復(fù)等位現(xiàn)象的經(jīng)典例證。這些基礎(chǔ)知識對于高校學(xué)生來說可能在高中的時候就已經(jīng)獲得。因此，在大學(xué)開展相關(guān)教學(xué)時，除了簡單介紹這3個主要的復(fù)等位基因外，還可以深入講述新的研究結(jié)果，到目前為止通過分子生物學(xué)方法已經(jīng)確定了160多個^50等位基因，只是目前國際上以4川7基因作為等位基因的參比序列，其他基因均與其緊密相關(guān)，非常保守。在此基礎(chǔ)上ABO血型又可分為許多亞群，其中A血型表現(xiàn)出最多的亞型。在紅細胞血型系統(tǒng)中還有一種Rh血型，分為Rh陽性和Rh陰性。Rh血型主要由3個緊密連鎖的基因D/d、C/c、E/e決定，這3個基因以單倍型方式傳遞，屬于擬等位基因。這樣在講解原有知識基礎(chǔ)上，又不局限于原有知識范圍，由ABO血型到Rh血型，由復(fù)等位基因引出擬等位基因，在教學(xué)方法上可以通過相互比較，舉例分析，擴大學(xué)生的知識面，提
高他們的學(xué)習(xí)興趣。
人類的血型是不是一生恒定不變的？面對這個問題，很多學(xué)生都會認為血型是由遺傳決定，不會改變。其實人類的血型也會發(fā)生變異，如急性白血病以及再生障礙性貧血可以使血型抗原減弱，骨髓增生異常綜合征可以導(dǎo)致血型抗原丟失等。而且，健康人也存在血型變異的現(xiàn)象，但是這個是與細胞表面血型物質(zhì)受到掩蓋以及人體存在一些稀有ABO等位基因有關(guān)。這些新的知識可以向?qū)W生很好地展示“遺傳和變異”，利用身邊的血型案例調(diào)動學(xué)生的學(xué)習(xí)積極性，使他們積極主動地掌握遺傳學(xué)的精髓。
此外，最近幾年疾病引發(fā)基因甲基化和突變的研究'又可以結(jié)合表觀遺傳學(xué)的內(nèi)容開展教學(xué)。
2.2紅細胞血型的細胞膜糖基特征和生化機制在教學(xué)中的開展
人類ABO基因位于9號染色體長臂(9q34)，其基因產(chǎn)物是一些專一性的糖基轉(zhuǎn)移酶，可以催化血型抗原前體特定部位的糖基轉(zhuǎn)移，從而控制ABO血型抗原的生物合成。其中4基因編碼產(chǎn)物為N-乙酰-D-半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶(簡稱A酶)，可以產(chǎn)生常見的A抗原；S基因編碼產(chǎn)物ci-l，3-D-半乳糖轉(zhuǎn)移酶(簡稱B酶)，可以產(chǎn)生常見的B表面抗原；和S基因同時存在產(chǎn)生的等位基因，其編碼產(chǎn)物具有A酶和B酶的特異性，在紅細胞表面上產(chǎn)生不同強度的A和B抗原；而O基因則是第258位和第349位堿基缺失導(dǎo)致的密碼子移位，使終止密碼提前出現(xiàn)，合成了無酶活性的短肽，因而體內(nèi)沒有A酶和B酶，也不能催化糖基轉(zhuǎn)移，只有前體物質(zhì)H的產(chǎn)生為H抗原(圖1)。因此ABO血型有時也稱為八811型[71。這樣，不同的、B、0基因編碼不同的多肽，產(chǎn)生具有不同功能的糖基轉(zhuǎn)移酶，非常簡單地引出了遺傳學(xué)中經(jīng)典的基因與酶的關(guān)系的“一個基因一條多肽(一個基因一個酶)假說”,使學(xué)生很容易獲得一個基因決定一條相應(yīng)的多肽鏈(酶)的結(jié)構(gòu)，并相應(yīng)地
影響這個多肽(以及由單條或多條多肽鏈組成的酶）的功能這種遺傳學(xué)思想，達到良好的教學(xué)效果。
此外，最新研究發(fā)現(xiàn)ABH抗原除表達在血細胞表面以外，還可以出現(xiàn)在除腦脊液外的分泌液中；有大約80%的個體具有產(chǎn)生這些可溶性抗原的遺傳基因；這種分泌抗原的表達由雙結(jié)構(gòu)基因控制，即第19號染色體2個緊密連鎖的Ft/n(用和基因座。ABO血型抗原都由前體H物質(zhì)合成，SeAe基因和丑冷基因都可以控制合成H物質(zhì)；簡單來說，基因的表達決定體液中是否出現(xiàn)ABH抗原，H/h基因的表達決定紅細胞上是否出現(xiàn)ABH抗原。但是，并不是所有帶m基因的個體唾液中都分泌ABH物質(zhì)，還要受到Wh基因的制約，其中hh型(即孟買型)均為非分泌型[7]。這樣又引出了遺傳學(xué)中一個很重要的概念--上位基因，很重要的遺傳學(xué)現(xiàn)象--上位效應(yīng)。這些屬于遺傳學(xué)中基因互作的重點內(nèi)容，而且發(fā)生基因相互作用的非等位基因仍然遵循孟德爾分離和自由組合定律，后代的基因型及其比例是可預(yù)計的，所以在遺傳學(xué)教學(xué)中還可用于親子鑒定、重大遺傳疾病的關(guān)聯(lián)分析、人種演化、群體遺傳分析等相關(guān)內(nèi)容。
2.2相關(guān)技術(shù)的拓展應(yīng)用
ABO血型的分子檢測是分子遺傳學(xué)教學(xué)中PCR技術(shù)拓展應(yīng)用的案例。血型基因的表達影響血型的表現(xiàn)型，表型相同的個體其基因型不一定相同。如何區(qū)分iAiA、Pi0在表現(xiàn)型都是A型和iBiB、iBi0在表現(xiàn)型都是B型的個體，可以根據(jù)A、B、0血型基因堿基的差異，應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)分型人類ABO血型的方法。這種方法可以對個體血型(血型基因型)進行判定：是屬于AA型、AO型，還是BB型或BO型。在這個基礎(chǔ)上，我們進行了改進，并結(jié)合教學(xué)進程，作為自選實驗在學(xué)生中開設(shè)，獲得了學(xué)生的好評。在135個學(xué)生中開展自選實驗，其中有80%的學(xué)生選擇ABO血型鑒定這個實驗，并表示對這個實驗很感興趣。
此外，還可通過分析核苷酸來確定分泌型ABH血型的Se基因型。主要基因分型技術(shù)有：（l)PCR-序列特異性引物(PCR-SSP)，這是一種新的基因多態(tài)性分析技術(shù)，根據(jù)基因座某一堿基的差異設(shè)計一系列引物，特異性引物僅擴增與其對應(yīng)的等位基因， 而不擴增其他的等位基因；（2)PCR-DNA測序法，先通過PCR擴增基因的主要片段，然后測定序列;(3)PCR-限制性內(nèi)切酶法，用對位點特異的限制性內(nèi)切酶消化基因，再通過Southernblot分析來確定。目前，PCR-SSP常用于胎兒血型鑒定及白血病引起的血型抗原異常等血型鑒定。隨著450基因結(jié)構(gòu)和研究方法的迅速發(fā)展，AB0血型定型也將進入基因定型的時代，揭示更多的關(guān)于AB0基因和AB0血型表觀遺傳學(xué)等方面的奧秘。
在教學(xué)過程中還可以設(shè)計一系列與血型相關(guān)的論題，引導(dǎo)學(xué)生査閱相關(guān)方面的最新進展，總結(jié)出血型與人類疾病和性格之間的關(guān)系以及蘊涵的遺傳學(xué)原理。學(xué)生可以分組制作PPT討論，還可針對某一論題，學(xué)生組隊分為正反兩方，開展辯論式討論。一學(xué)期可以安排一次課時(45分鐘)開展辯論式討論,前30分鐘讓學(xué)生正反方陳述觀點，列舉證據(jù)開展辯論，后15分鐘用于總結(jié)和點評。在這個模式下，幾乎所有的學(xué)生都積極主動地參與進來，將引導(dǎo)、鼓勵與考評相結(jié)合，充分調(diào)動了學(xué)生學(xué)習(xí)的積極性[11]。開展“血型是否可以決定性格”類似專題的辯論式討論，既增加了遺傳學(xué)教學(xué)的興趣性及可接受性，還可以使學(xué)生的思維在辨析中得到操練。正反兩方隊員通過收集資料和案例，與同學(xué)辯論解釋的過程中，不僅掌握了深奧的科學(xué)知識，而且還與現(xiàn)實生活相聯(lián)系，并且將遺傳學(xué)應(yīng)用于實際，填補了傳統(tǒng)教學(xué)在知識靈活認知與實踐中的不足。
3以血型為案例開展遺傳學(xué)教學(xué)的優(yōu)點
作為日常生活中被人們廣泛熟知的遺傳學(xué)常識，血型遺傳學(xué)的研究歷程符合遺傳學(xué)的發(fā)展規(guī)律與教學(xué)規(guī)劃，其作為遺傳學(xué)教學(xué)案例有著不可替代的優(yōu)勢：
【關(guān)鍵詞】現(xiàn)代生物技術(shù)；環(huán)境檢測；應(yīng)用
1引言
現(xiàn)階段，我國常見現(xiàn)代生物技術(shù)包括生物傳感器技術(shù)、生物酶技術(shù)以及生物芯片技術(shù)等，這些監(jiān)測技術(shù)具有較強的特異性、靈敏性和準(zhǔn)確性，操作簡單快速，因此在目前的環(huán)境檢測工作中都發(fā)揮了十分重要的作用，大大提高了環(huán)境檢測的質(zhì)量和水平，加強對其分析研究有著十分重要的意義。
2現(xiàn)代生物技術(shù)的基本簡介
現(xiàn)代生物技術(shù)其主要包含有分子生物學(xué)、微生物學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)以及免疫學(xué)等多種理論，而且與化學(xué)、計算機以及微電子等多種學(xué)科相互結(jié)合，綜合性較強，因而，具有十分廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域?，F(xiàn)代生物技術(shù)主要的研究對象是生物，主要的研究目的是為了實現(xiàn)對資源的有效開發(fā)和利用，操作過程簡單快捷，能夠有效地減少資源浪費和環(huán)境污染?，F(xiàn)代生物技術(shù)所開發(fā)的產(chǎn)品具有較高的純度和較高的安全性，產(chǎn)品質(zhì)量可靠，最大程度地滿足了人們的使用需求，實現(xiàn)了連續(xù)化的操作，有利于建立資源節(jié)約型、環(huán)境友好型的生態(tài)環(huán)境。現(xiàn)代生物技術(shù)目前主要在農(nóng)業(yè)生物技術(shù)、植物生物技術(shù)、醫(yī)學(xué)生物技術(shù)以及環(huán)境生物技術(shù)等領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)了廣泛的應(yīng)用。
3環(huán)境檢測中常用的幾種現(xiàn)代生物技術(shù)
3.1生物傳感技術(shù)
生物傳感器的技術(shù)基礎(chǔ)是固定化酶技術(shù)，能夠?qū)⒆R別與感知的信息轉(zhuǎn)化成電子信號，并通過電子信號裝置對其進行控制，最后被檢測的物質(zhì)可以通過電子器件檢測出來，然后將其轉(zhuǎn)化成已被檢測的電子信號。目前生物傳感技術(shù)是環(huán)境檢測中應(yīng)用最多的技術(shù)。
3.2基因探針與PCR技術(shù)
基因探針技術(shù)中的非放射性核酸探針可以應(yīng)用于環(huán)境檢測中，主要應(yīng)用于環(huán)境中細菌或病毒的檢測，且非放射性核酸探針對病毒及細菌的檢測還十分靈敏，核酸雜交技術(shù)應(yīng)用于環(huán)境微生物的監(jiān)測中不僅更加安全可靠，還十分快速有效，目前核酸探針及PCR技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于水環(huán)境中如大腸桿菌、志賀氏菌等微生物的檢測。
3.3酶免疫檢測技術(shù)
酶免疫監(jiān)測技術(shù)是利用抗原和抗體的特異性反應(yīng)而研發(fā)的，該技術(shù)將酶進行標(biāo)記，然后再將標(biāo)記過的酶與待檢測的抗原進行檢測，根據(jù)其出現(xiàn)的免疫學(xué)特征反應(yīng)通過比對確定待檢測病毒或細菌的種類。酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)是目前應(yīng)用最為廣泛的一種酶免疫檢測技術(shù)，其主要應(yīng)用于水質(zhì)檢測中。3.4生物芯片技術(shù)生物芯片技術(shù)是利用微電子技術(shù)研發(fā)的一種微加工技術(shù)，可以將作為探針的分析固定與于固定相表面，然后根據(jù)構(gòu)建的生物化學(xué)分析系統(tǒng)進行分析，從而實現(xiàn)對蛋白質(zhì)、細胞等生物學(xué)組成成分進行快速準(zhǔn)確的檢測，其主要應(yīng)用于水污染中的化學(xué)物質(zhì)毒性的檢測。
4在環(huán)境檢測中現(xiàn)代生物技術(shù)的具體應(yīng)用
4.1生物傳感技術(shù)的應(yīng)用
數(shù)字科技和生物技術(shù)的快速發(fā)展，各個學(xué)科也都實現(xiàn)了不斷的進步與發(fā)展，并且在發(fā)展過程中實現(xiàn)了學(xué)科的相互交叉和融合。生物傳感技術(shù)因其具有高度集成化、微型化以及自動化的特點，因此在環(huán)境檢測中實現(xiàn)了廣泛的應(yīng)用。生物傳感器能夠?qū)崿F(xiàn)生物反應(yīng)與電信號的轉(zhuǎn)換，為環(huán)境檢測提供了大量快速有效的分析手段，實現(xiàn)了食品工業(yè)以及環(huán)境檢測的技術(shù)革命。生物傳感技術(shù)的應(yīng)用理論基礎(chǔ)是實現(xiàn)傳染物與生物層之間專一的固定化作用，作用原理就是通過被測對象與生物組之間的相互作用，然后利用電子元器件將對被測對象的監(jiān)測轉(zhuǎn)化為比較容易被識別的電子信號，最終再通過電子信號設(shè)備和裝置對電子信號進行識別和分析，實現(xiàn)對監(jiān)測對象的有效控制。生物傳感技術(shù)具有測定速度快、操作簡單、反應(yīng)靈敏準(zhǔn)確、成本低等優(yōu)點，因此在未來的環(huán)境檢測中一定會實現(xiàn)更加廣泛的應(yīng)用和推廣。
4.2基因探針和PCR技術(shù)的應(yīng)用
不同的微生物病原體具有不同的致病劑量，因此確定水樣中病原體的數(shù)量和種類提高檢測的準(zhǔn)確度顯得異常重要水體污染問題已引起了人們的極大關(guān)注，確定自然水體或污水水樣中受病原體或化學(xué)類污染物污染的程度和快速確定污染源是一個難點問題。飲用水樣品中只有不到1%的微生物可經(jīng)實驗室培養(yǎng)。因此，用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法研究微生物群落，不能反映環(huán)境的真實情況。DNA損傷評價污染物遺傳毒性的一個很有價值的生物指標(biāo)，PCR技術(shù)的應(yīng)用使得在分子水平分析DNA損傷之一DNA突變有了很大的進展，提供了一種在分子水平上分析環(huán)境生物DNA損傷和檢測病原體的簡便方法，該方法克服了傳統(tǒng)方法的缺陷，更利于提高環(huán)境檢測的效率和準(zhǔn)確性。PCR有許多不同種類，如實時定量PCR，多重PCR等，用PCR得到的母的片段可用于微生物檢測。目前已有將PCR技術(shù)用于飲用水中大腸桿菌的檢測；用于制備基因工程中的目的片段；用于DNA雜交技術(shù)中DNA探針的制備；用于環(huán)境生物多態(tài)性的分析。DNA探針是用生物素、熒光素等物質(zhì)進行標(biāo)記的能夠與待測基因進行特異性互補產(chǎn)生雜交信號的DN段。熒光探針、寡聚核苷酸探針等已被應(yīng)用于監(jiān)測水中的大腸桿菌，取得了很好的結(jié)果。為了更靈敏、快速的檢測水中大腸桿菌，目前DNA探針技術(shù)多于PCR技術(shù)結(jié)合使用。PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性一退火一延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：（1）模板DNA的變性模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；（2）模板DNA與引物的退火（復(fù)性）模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；（3）引物的延伸DNA模板一引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性———退火———延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2~4min，2~3h就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。到達平臺期（Plateau）所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。PCR技術(shù)在環(huán)境檢測中的基本原理見圖。
4.3生物酶技術(shù)的具體應(yīng)用
目前，我國的環(huán)境檢測工作中另一個應(yīng)用比較廣泛的現(xiàn)代生物技術(shù)就是生物酶技術(shù)。①生物酶技術(shù)的處理功效高。生物酶技術(shù)的作用原理是將微生物與酶進行有效的結(jié)合，能夠快速有效地進行污染物的降解，從而增強環(huán)境檢測過程中的污染處理功效。②生物酶技術(shù)在環(huán)境檢測中的適應(yīng)性更加廣泛。生物酶技術(shù)有效地降低了微生物的生存要求，為微生物創(chuàng)造了更加適宜的溫度和pH條件，大大增加了微生物的作用效果。③生物酶技術(shù)與其他方法相比更具有針對性。生物酶技術(shù)目前被廣泛地應(yīng)用于不同的領(lǐng)域和不同的環(huán)境，因此，在使用時可以充分地根據(jù)實際情況進行選擇，從而采取更具有針對性和效力的方案進行監(jiān)測。④生物酶技術(shù)的污染治理成本也較低。生物酶技術(shù)的應(yīng)用不需要引進龐大的設(shè)備和裝置，大大降低了治理成本和投資成本，并且具有顯著的治理效果。在此，主要就生物酶技術(shù)在處理水污染中的具體應(yīng)用進行了簡要的分析。某城市生活污水處理廠各構(gòu)筑物內(nèi)滯留污水總水量約為1.5萬t；外觀呈現(xiàn)黑色，并散發(fā)臭味。經(jīng)環(huán)保部門對滯留污水進行采樣監(jiān)測，監(jiān)測數(shù)據(jù)如表1。從表1可知，滯留污水中的COD、NH3-N、硫化物等均超標(biāo)，最高超標(biāo)達10倍以上。該滯留污水中混有大量制革廢水及化工廢水。制革廢水由強堿性的浸灰脫毛廢水和弱酸性的鞣革廢水組成，前者含有高濃度的氯化物、硫化物、表面活性劑、防腐劑、油脂、蛋白質(zhì)及SS等污染物；后者含有高濃度的鞣料、化學(xué)助劑及染料等。制革混合廢水呈堿性、有毒性、難降解物質(zhì)含量高，外觀污濁，氣味難聞。而對滯留污水投加高效復(fù)合生物酶藥劑進行應(yīng)急處置后，高效復(fù)合生物酶對于滯留污水中的污染物進行高效催化降解，逐步改善滯留污水的水質(zhì)狀況。投加高效復(fù)合生物酶藥劑后，一周即可使其中的污染物降解30～50%。由表2可以看出，高效復(fù)合生物酶對滯留污水的應(yīng)急處置有明顯的效果。投加高效復(fù)合生物酶藥劑一周后，經(jīng)相關(guān)環(huán)保部門對污水進行采樣監(jiān)測，監(jiān)測結(jié)果見表2。
4.4生物芯片技術(shù)的具體應(yīng)用
在進行環(huán)境檢測時應(yīng)用生物芯片技術(shù)時能夠有效地提高環(huán)境檢測的質(zhì)量和水平，使得我國環(huán)境檢測技術(shù)得到進一步的發(fā)展。生物芯片技術(shù)可以自動、快速、準(zhǔn)確地監(jiān)測出不同基因的表達情況和環(huán)境因素對基因的影響作用。生物芯片技術(shù)目前所采用的載體主要有組織芯片、蛋白質(zhì)芯片以及基因芯片等，生物芯片技術(shù)通過對細胞基因組的詳細分析，準(zhǔn)確篩選DNA的多態(tài)性變化和突變過程，從而確定出環(huán)境污染對生物基因水平的影響，實現(xiàn)對污染的科學(xué)監(jiān)測。隨著生物芯片技術(shù)的不斷發(fā)展，其在環(huán)境檢測過程中逐漸成為新的研究方向和研究概念，未來具有更加廣泛的應(yīng)用前景。
5結(jié)語
關(guān)鍵詞 病毒學(xué) 方法 分子細胞水平
中圖分類號：G644 文獻標(biāo)識碼：A
相對動物學(xué)或者植物學(xué)這些傳統(tǒng)學(xué)科，病毒學(xué)是一門始創(chuàng)于20世紀40年代的新興學(xué)科。雖然在此之前，就有發(fā)現(xiàn)能通過細菌過濾器的煙草花葉病致病因子的科學(xué)家D.Ivanofsky，以及發(fā)現(xiàn)具有濾過性的口蹄疫病原的科學(xué)家Loeffler和Frosch，但是基于歷史條件和知識水平的限制，人們或許觀察到了病毒引起的自然現(xiàn)象，卻無法對其產(chǎn)出真正科學(xué)的認識。
病毒學(xué)的里程碑事件應(yīng)屬1935年美國科學(xué)家Stanley對于煙草花葉病毒的提純，使人們不再空泛地想象病毒的存在，而是真切地觀察和接觸到病毒，為今后的研究開辟了廣闊的道路。隨后，觀察手段，培養(yǎng)方法，以及相關(guān)的病理性研究手段的不斷提升，也使得病毒學(xué)這樣一門起步較晚的學(xué)科開始了飛速發(fā)展。
回顧病毒學(xué)研究的發(fā)展歷程，不難發(fā)現(xiàn)，學(xué)科的發(fā)展很大程度上依賴于技術(shù)的進步與革新，以及與相關(guān)學(xué)科的借鑒與學(xué)習(xí)。故了解和掌握病毒學(xué)方法技術(shù)的發(fā)展歷史以及技術(shù)要求，對于學(xué)科的研究，以及技術(shù)的創(chuàng)新，都有諸多裨益。
1 病毒鑒定檢測的相關(guān)方法技術(shù)
對于病毒最直觀的認識無疑是其生物學(xué)上特征，如病毒的理化性質(zhì)（如病毒粒子的形態(tài)、大小、對理化因子的耐受性、特外存活期等）以及在寄主上的反應(yīng)（如寄主范圍、癥狀表現(xiàn)、傳播方式等）。目前，病毒生物學(xué)特征的研究鑒定方法主要分為三大類：顯微成像技術(shù)（或相關(guān)針對病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察的技術(shù)）、免疫-血清學(xué)檢測和分子生物學(xué)檢測。
1.1 病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察技術(shù)
眾所周知，病毒顆粒的大小遠小于普通細菌，所以對病毒最直觀的鑒定方法就是使用電鏡觀察，它可以直接地看到病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)、存在與否。自第一臺電子顯微鏡的誕生，這門技術(shù)已為病毒學(xué)在內(nèi)的多種生物學(xué)科作出了重要的貢獻，優(yōu)點也十分明顯，操作簡便，快捷有效，所以，即使是在進入了分子研究水平的今天，電子顯微鏡仍然發(fā)揮著它不可替代的作用。
另外，在原始的技術(shù)基礎(chǔ)之上加以改進也形成了一些針對特殊觀察對象的電鏡技術(shù)，如電鏡負染技術(shù)和免疫電鏡檢測技術(shù)等。低溫電鏡技術(shù)，就是一種結(jié)合電鏡技術(shù)和低溫結(jié)晶觀察病毒的三維結(jié)構(gòu)的技術(shù)，其優(yōu)點不僅在于其分辨率更高，而且對于病毒樣品的損傷和失真的概率都大大減小，常用于極微量和高保真要求的病毒觀察檢測。
X-射線衍射技術(shù)是通過掃射病毒微晶得到的衍射圖像來分析還原原始的病毒結(jié)構(gòu)，但為了保證衍射圖像的準(zhǔn)確性，往往對樣品的純度和顆粒完整性要求較高，所以這種技術(shù)的使用范圍相對受限。
核磁共振技術(shù)，相對于前面提到的技術(shù)，對于操作的要求更低，運用范圍也更廣，但是對于結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性判斷略低。此技術(shù)主要用于病毒短肽的分析以及蛋白小分子構(gòu)象變化的研究。
1.2 免疫-血清檢測方法
此類技術(shù)的原理主要根據(jù)病毒的侵染性以及其作為白的特性而設(shè)計的。運用最為廣泛的還是血清學(xué)測試，即利用血清中可以和具有某種特定結(jié)構(gòu)特征的病毒結(jié)合的抗體，從而進行病毒的定性定量分析。此法也廣泛應(yīng)用用于醫(yī)學(xué)臨床的診斷，操作簡便，低廉有效。
酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）也是利用特異抗體吸附病毒顆粒的原理，只是在抗體上附帶了酶標(biāo)記，從而使反應(yīng)可以有顏色強弱的變化，利于定時定量監(jiān)測病毒濃度。此法靈敏度高，且不受濃度范圍或其他抑制劑的干擾，也越來越多地應(yīng)用于相關(guān)的生產(chǎn)實踐中。
免疫組化技術(shù)也是將抗體帶上特殊的顯色基團，使其游離時不顯色，而于抗原物質(zhì)結(jié)合后顯色。利用這個特點，可以檢測特定組織中不同區(qū)域的病毒含量已經(jīng)分布特點，利于進行組織性毒理分析。
1.3 分子生物學(xué)檢測方法
病毒寄生在宿主細胞內(nèi)，但它又有不同于宿主細胞的特異基因組序列，特異序列的存在就說明病毒的存在，這就是分子生物學(xué)檢測病毒的原理。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是其中最為常用的一種檢測手段，其原理即利用DNA半保留復(fù)制的特點，以原始DNA為模板合成兩條一樣的雙鏈，從而達到擴增量指數(shù)增長，DNA總量可檢測的目的。另外，由于病毒的核酸有的是DNA，有的是RNA，所以常規(guī)的PCR以及反轉(zhuǎn)錄PCR即可針對不同的病毒基因進行檢測。
實時定量PCR與傳統(tǒng)PCR基本相同，只是在體系中加入熒光基團，反應(yīng)中利用CCD實時讀取熒光信號，檢測。不僅減少的污染和浪費，也使定量快速而方便，可以實現(xiàn)多樣品和高通量的反應(yīng)。
核酸原位雜交的原理是利用生物素編輯的cDNA探針來雜交組織中的樣本，從而確定病毒在宿主中的分布和載毒量。該技術(shù)，往往與免疫組化一起使用。
dsRNA技術(shù)是利用dsRNA在一定條件下與纖維素特異結(jié)合的性質(zhì)，從來快速簡便的提取檢測出病毒顆粒中的dsRNA等，高效準(zhǔn)確，在普通實驗室和生產(chǎn)工廠中都有所應(yīng)用。
2 病毒的分離與培養(yǎng)的相關(guān)技術(shù)方法
2.1 病毒的提純技術(shù)
作為病毒學(xué)研究的重要技術(shù)前提，病毒的提純質(zhì)量往往影響了后續(xù)一系列的步驟，所以其重要性不言而喻。由于病毒的生長特性、理化性質(zhì)和宿主都差異頗大，提純的方法也不盡一致。
在病毒研究初期，沉淀法最常被使用，其主要利用病毒的蛋白外殼，改變?nèi)軇┬再|(zhì)，從而分離病毒粒子。相對而言簡便快速，但也常存在粗糙易變性的缺點。
色譜法源于化學(xué)中多組分的分離，由于生物成分的多樣性，也常使用該技術(shù)。色譜法主要分為吸附法、柱層析法和電泳法，都是利用較為溫和的環(huán)境，以及病毒的特異吸附或凝集等特質(zhì)而設(shè)計的技術(shù)。種類繁多，應(yīng)用廣泛。
超速離心利用樣品中不同成分擁有不同的沉降系數(shù)，在離心過程中，不同成分會在溶劑的特定位置形成區(qū)帶，從而達到分離提純的目的。此法常使用生物活性溶劑，且離心本身對病毒粒子損傷較小，故常用于理想的病毒快速分離技術(shù)。
2.2 病毒的獲取
最初的植物病毒學(xué)和動物病毒學(xué)的諸多研究都是建立在活的宿主體系上的，并且至今仍在應(yīng)用，如生產(chǎn)不能體外繁殖的病毒、研究病毒感染的病理作用、檢測疫苗的安全性等。但動物宿主體系存在太多弊病，隨著細胞培養(yǎng)技術(shù)和分子生物學(xué)的發(fā)展，有逐漸被淘汰的趨勢。
現(xiàn)在，病毒的獲取主要是三種途徑：從宿主直接獲取、感染宿主擴增病毒、直接合成，其中后兩種途徑使用更為廣泛。
感染宿主擴增病毒即要使用到組織細胞培養(yǎng)，這項技術(shù)本來屬于細胞學(xué)的范疇，后由于動物源性或者細菌源性的病毒研究需求，此技術(shù)也越來越多地應(yīng)用于病毒學(xué)的研究中。如，空斑分析最初用于測定噬菌體含量，而今也逐漸普及為動物病毒的研究中去。
直接合成法則是利用動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將病毒的遺傳信息整合進目標(biāo)動物中，在動物體內(nèi)完成基因的表達，蛋白的合成，以及病毒的組裝等步驟。而動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)也是現(xiàn)今生物領(lǐng)域的熱點內(nèi)容，技術(shù)繁多，更新迅速，也為病毒的研究提供了良好的基礎(chǔ)。
3 病毒的功能機制研究的相關(guān)技術(shù)方法
3.1 病毒的遺傳學(xué)的研究
關(guān)于病毒遺傳學(xué)的研究和細菌等微生物的遺傳學(xué)研究技術(shù)相似，如PCR等。但是病毒的遺傳物質(zhì)除了可能是DNA還可能是RNA，而且現(xiàn)在對于RNA病毒的研究居多，所以針對性的技術(shù)也與細菌等微生物的遺傳學(xué)研究技術(shù)有所區(qū)別。
對于RNA病毒使用最多的是反向遺傳學(xué)技術(shù)，最初即使用反轉(zhuǎn)錄PCR得到病毒RNA的cDNA，從而完成病毒基因組的探索工作，以達到了解或有目的性改造病毒基因組實現(xiàn)生產(chǎn)應(yīng)用的目的。此法對于類型多樣的病毒研究提供的最為基礎(chǔ)的遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，為疫苗開發(fā)篩選、新型病毒載體等多方面都給予有力的技術(shù)支持。
針對病毒易變異的特點，單鏈構(gòu)想多態(tài)性檢測技術(shù)（SSCP）則理想地解決了這一問題。近年來，對于多種模式生物的基因組測序的發(fā)展，越來越多的研究開始著重于探索基因變異的問題，而SSCP技術(shù)正是這樣發(fā)展起來的。其主要用于檢測基因點突變和短序列的缺失和插入，為病毒的分子演化規(guī)律以及流行病學(xué)提供充分的證據(jù)。
基因芯片技術(shù)的概念來源于計算機芯片，即將大量寡聚核苷酸以陣列形式有序固定于載體表面，與待測樣本的病毒分子雜交，然后利用化學(xué)發(fā)光或同位素等顯色方法，用CCD等儀器對雜交信號進行高效檢測分析。主要用于病毒基因表達譜和基因多態(tài)性等方面的研究。
3.2 病毒表達機制的研究
在病毒的表達機制研究中，主要是利用不同的檢測手段，判斷病毒表達的具體情況，并對于病毒表達的情況進行總結(jié)歸納，研究其時空上的機制和規(guī)律。
Northern Blots即針對病毒RNA樣品的技術(shù)手段，原理與Southern Blots相似，利用探針與固相RNA雜交，再對探針分子的圖像進行捕獲和分析。此法特異性高，常用于分析已知基因的表達情況。
mRNA表達差異技術(shù)主要使用反轉(zhuǎn)錄PCR以及等量不同宿主的定量檢測，來確定抗病種和感病種的差異表達基因，從而進一步確定造成品種差異的原因。
3.3 病毒蛋白質(zhì)的研究
病毒蛋白決定了病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)，常作為抗原來激發(fā)人體內(nèi)的免疫反應(yīng)，作用于宿主細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，導(dǎo)致宿主細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生紊亂；并且一些病毒蛋白具有酶的作用，可作為細胞毒素作用于宿主細胞。
大范圍而言，病毒蛋白質(zhì)研究的技術(shù)，都隸屬于蛋白質(zhì)組學(xué)的研究范疇之內(nèi)，只不過針對不同特性的蛋白，往往會選取最為有效而簡便的技術(shù)方法進行研究。而由于蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)、化學(xué)生物特性等多方面差異很大的特點，其針對性技術(shù)也是五花八門，在此僅列舉較為常用的技術(shù)，以供研究者學(xué)習(xí)參考。
經(jīng)典的方法有親和層析、抗體受體法、抗細胞受體法、抗獨特型抗體法、病毒覆蓋蛋白法。大多還是利用病毒蛋白和抗體蛋白或者其他蛋白或大分子物質(zhì)的作用，來檢測病毒蛋白的特性。雖然這些方法快速簡便，但是由于方法本身較為粗糙，樣品用量較大，準(zhǔn)確性存疑等問題，現(xiàn)在僅在低要求情況下使用。
現(xiàn)代的方法則更加豐富，也分別具有各自的特點，常被運用于現(xiàn)在的病毒蛋白的研究。
噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)是利用噬菌體本身表達的兩種結(jié)構(gòu)蛋白會暴露在噬菌體表面，故將外源基因倒入兩個結(jié)構(gòu)蛋白基因間，使外源序列一起表達，然后讓表達產(chǎn)物與大量配體結(jié)合，篩選特殊結(jié)合性配體。但此法表達出來的蛋白可能與天然狀態(tài)不符，所以使用較為受限。
免疫共沉淀是一種成熟蛋白作用技術(shù)，其原理為在溶液或細胞中，用一種蛋白的抗體耦合可與此蛋白特異結(jié)合的另一蛋白，從而形成一抗體兩蛋白的沉淀，從而獲取具有結(jié)合餌蛋白能力的未知蛋白，探索細胞中蛋白作用機制。
酵母雙雜交技術(shù)是利用真核基因的特殊表達機制，通過將兩個蛋白的編碼序列整合在同一酵母細胞內(nèi)的特殊轉(zhuǎn)錄激活域附近，若兩種蛋白可以發(fā)生相互作用，則會激活相應(yīng)的報告基因，從而報告蛋白的相互作用。此法常用于篩選病毒蛋白的特異膜蛋白受體。
除了以上列舉的技術(shù)之外，還有cDNA文庫技術(shù)、質(zhì)譜分析技術(shù)、GST Pull-down技術(shù)、串聯(lián)親和純化、熒光能量共轉(zhuǎn)移等多種技術(shù)應(yīng)用于蛋白互作的研究。
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[9] 魏太云等.P CR-SSCP技術(shù)在植物病毒學(xué)上的應(yīng)用.福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2000.29（2）.
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人物=P
普雷斯頓?埃斯特普=E
P：你在你的著作《長壽的基因》（The Mindspan Diet）一書中提到，“通過飲食調(diào)理我們的基因，積極影響基因表達，就能讓我們保持健康的身體狀態(tài)和旺盛的大腦生命力。其中，低含鐵量、低血糖指數(shù)的精制碳水化合物（LIGIR），是有益于健康長壽的最佳碳水化合物?！笔聦嵣希妼绿妓衔?、全谷食物和鐵元素對健康的影響有諸多誤解，你認為是什么造成了這樣的誤解？
E：精致碳水化合物目前有一個壞的形象，許多人聲稱它們會導(dǎo)致超重、肥胖、糖尿病等問題。但是某些精致碳水化合物，如白米飯和面食，在歷史上是最好的有助生理長壽和心智長壽（編者注：心智壽命指大腦正常運轉(zhuǎn)的時間和表現(xiàn)，是衡量人體健康的最終指標(biāo)的基礎(chǔ)）的食物。另一方面，人們曾被告知富含鐵的食物和全谷物是有益的，但是心智長壽的人從未吃過富鐵的食物，也很少吃全谷物。之所以會產(chǎn)生誤解，原因有兩個：許多科學(xué)家忽視了與個人偏見沖突的證據(jù);大多數(shù)人和科學(xué)家不理解衰老生物學(xué)，也不理解隨著年齡的增長我們所需的是如何變化的。
P：我們知道缺鐵易造成貧血，但是鐵元素過量積存卻易造成神經(jīng)退行性疾病，因此在健康平衡上，公眾該如何選擇含有鐵元素的飲食？
E：在食物供應(yīng)良好的國家，貧血在男性和絕經(jīng)后婦女中很少見。而鐵缺乏的診斷通常需要血液檢查，因為人們經(jīng)常沒有明顯的癥狀。重要的是要有合適的血液檢測來檢測鐵含量以確定適合每個人的飲食量。一種血清鐵蛋白測試很關(guān)鍵，還有我在《長壽的基因》中討論的其他類型的測試。
P：你的書中提到日本、地中海地區(qū)的人因為擁有良好的飲食習(xí)慣，被普遍認為心智更長壽。其他國家的人在效仿他們的飲食習(xí)慣時應(yīng)該注意些什么？
E：有很多重要的因素，包括以下這些：限制紅肉和其他富含鐵的飲食，從好的碳水化合物（白米、面條等）中得到膳食能量（卡路里），只吃中等量的蛋白質(zhì)（特別是動物蛋白質(zhì)），少到中等量的日常魚和海鮮，并且吃發(fā)酵和可發(fā)酵的食物。
P：通常，不同的飲食習(xí)慣會造成人體腸道菌群的差異，從而影響健康，我們在學(xué)習(xí)長壽地區(qū)的飲食習(xí)慣時，會否產(chǎn)生適得其反的效應(yīng)？
E：不會，大多數(shù)人，特別是大體上已經(jīng)吃得很好的中國人，應(yīng)該能夠毫無問題地過渡。對于大多數(shù)中國人來說，最重要的是減少肉類和動物蛋白質(zhì)的含量，這將提高腸道功能。
P：你提到，“所有的神經(jīng)退行性疾病都有相同的環(huán)境致病因素”，相同的環(huán)境治病因素是指什么？
E：這里是指，膳食鐵和富含鐵的食物。（編者注：《長壽的基因》里寫道，心智長壽達人的飲食有許多共同之處，其中之一就是減少鐵元素的攝入。）
P：你在書中提到，止痛藥如布洛芬，可以降低患神經(jīng)退行性疾病的風(fēng)險。請問原理是什么？
E：某些止痛藥可以減少癡呆和其他疾病有兩種可能的方式：其一，它們減少炎癥;其二，它們中的一些抑制腦中蛋白質(zhì)的聚集，這是造成阿爾茨海默氏病的元兇。
P：載脂蛋白E（apolipoprotein E，APOE，是一種多態(tài)性蛋白，其基因可以調(diào)節(jié)許多生物學(xué)功能）和淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP，一種廣泛存在于全身組織細胞上的單次跨膜蛋白，其經(jīng)蛋白酶裂解后會產(chǎn)生具有毒性作用的β-淀粉樣蛋白）是影響人們罹患阿爾茲海默癥的關(guān)鍵基因，這兩者具體怎樣作用于阿爾茲海默癥？
E：APOE負責(zé)將鐵轉(zhuǎn)運到腦脊液和腦中。APOE的最致病性變種（稱為e4，這是在老年人中唯一最有害的人類遺傳變異）比起弱致病性的變種會轉(zhuǎn)運更多的鐵到腦中。一旦鐵到了大腦中，就會與運輸、代謝它的關(guān)鍵組分相互作用，包括編碼蛋白質(zhì)的APP（淀粉狀蛋白前體蛋白）。（因而）鐵含量的增加會觸發(fā)淀粉樣前體蛋白（APP）的運作，而該蛋白的過量運作最終會導(dǎo)致蛋白質(zhì)與鐵的聚集和腦細胞死亡。
P：如果你是記者，關(guān)于你自己和你的書，你還想問什么？
E：記者應(yīng)該和科學(xué)家一樣關(guān)注論證和論據(jù)。如果我是一個記者，我會問“遵循某種飲食的原因是什么？你有什么證據(jù)表明這是正確的方法？”《長壽的基因》是唯一的一本分析心智長壽概念和歷史上心智長壽人群的著作。它解釋了關(guān)鍵的膳食因素如何影響生理壽命和心智壽命。（如果我是一個記者）我也會問包括我自己在內(nèi)的每一個關(guān)注健康膳食的作者的年齡，我會將他們的實際年齡與他們看起來的年齡進行比較，因為外表是衡量一個人衰老得快或慢的一個很好的指標(biāo)。遵循長壽飲食應(yīng)該會減慢衰老的，而且是很明顯的減慢。我是56歲，大多數(shù)人猜測我比我的實際年齡要年輕至少10歲。就在這個星期，一個同事猜測我不過才40出頭。此外，我還會問問每個健康飲食作者的關(guān)鍵生物指標(biāo)的檢測結(jié)果。而我的所有生物指標(biāo)（如血液的化學(xué)成分）都在理想的范圍，包括長壽的生物指標(biāo)，如血糖和體溫。
P：2016年你做過的最正確的決定？
E：我一直很幸運，并在2016年做了很多好的決定。2016年在中國度過了將近兩個星期是一個很好的決定。我有機會在一些大型的活動中發(fā)言，包括在上海的陸家嘴的TED。我遇到了許多美好的人，包括翻譯和出版了我的中文書的湛廬文化團隊。我還在清華大學(xué)和浙江大學(xué)會見教師和學(xué)生并做了演講。總的來說，去到中國，這是一個很棒的決定！
P：在過去一年中，有什么遺憾嗎？
E：我總是感到遺憾。即便我是一個快樂的人，但我通常也感到不滿意。我有一個了不起的導(dǎo)師，名叫喬治?丘奇，他是哈佛醫(yī)學(xué)院的遺傳學(xué)教授。喬治有一句名言：“如果你有時沒有感到失敗，那么你還不夠努力。”這就是我相信的，并且我以此為我的生活信條。