時間：2023-07-03 16:08:12
導語：在基因工程載體的種類的撰寫旅程中，學習并吸收他人佳作的精髓是一條寶貴的路徑，好期刊匯集了九篇優(yōu)秀范文，愿這些內容能夠啟發(fā)您的創(chuàng)作靈感，引領您探索更多的創(chuàng)作可能。
關鍵詞:生物技術;基因工程;細胞工程
現(xiàn)代生物技術的迅猛發(fā)展,成就非凡,推動著科學的進步,促進著經濟的發(fā)展,改變著人類的生活與思維,影響著人類社會的發(fā)展進程?，F(xiàn)代生物技術的成果越來越廣泛地應用于醫(yī)藥、食品、能源、化工、輕工和環(huán)境保護等諸多領域。生物技術是21世紀高新技術革命的核心內容,具有巨大的經濟效益及潛在的生產力。專家預測,到2010～2020年,生物技術產業(yè)將逐步成為世界經濟體系的支柱產業(yè)之一。生物技術是以生命科學為基礎,利用生物機體、生物系統(tǒng)創(chuàng)造新物種,并與工程原理相結合加工生產生物制品的綜合性科學技術。現(xiàn)代生物技術則包括基因工程、蛋白質工程、細胞工程、酶工程和發(fā)酵工程等領域。在我國的食品工業(yè)中,生物技術工業(yè)化產品占有相當大的比重;近年,酒類和新型發(fā)酵產品以及釀造產品的產值占食品工業(yè)總產值的17%。現(xiàn)代生物技術在食品發(fā)酵領域中有廣闊市場和發(fā)展前景,本文主要闡述現(xiàn)代生物技術在食品發(fā)酵生產中的應用。
一、基因工程技術在食品發(fā)酵生產中的應用
基因工程技術是現(xiàn)代生物技術的核心內容,采用類似工程設計的方法,按照人類的特殊需要將具有遺傳性的目的基因在離體條件下進行剪切、組合、拼接,再將人工重組的基因通過載體導入受體細胞,進行無性繁殖,并使目的基因在受體細胞中高速表達,產生出人類所需要的產品或組建成新的生物類型。
發(fā)酵工業(yè)的關鍵是優(yōu)良菌株的獲取,除選用常用的誘變、雜交和原生質體融合等傳統(tǒng)方法外,還可與基因工程結合,進行改造生產菌種。
(一)改良面包酵母菌的性能
面包酵母是最早采用基因工程改造的食品微生物。將優(yōu)良酶基因轉入面包酵母菌中后,其含有的麥芽糖透性酶及麥芽糖的含量比普通面包酵母顯著提高,面包加工中產生二氧化碳氣體量提高,應用改良后的酵母菌種可生產出膨潤松軟的面包。
(二)改良釀酒酵母菌的性能
利用基因工程技術培育出新的釀酒酵母菌株,用以改進傳統(tǒng)的釀酒工藝,并使之多樣化。采用基因工程技術將大麥中的淀粉酶基因轉入啤酒酵母中后,即可直接利用淀粉發(fā)酵,使生產流程縮短,工序簡化,革新啤酒生產工藝。目前,已成功地選育出分解β-葡聚糖和分解糊精的啤酒酵母菌株、嗜殺啤酒酵母菌株,提高生香物質含量的啤酒酵母菌株。
(三)改良乳酸菌發(fā)酵劑的性能
乳酸菌是一類能代謝產生乳酸,降低發(fā)酵產品pH值的一類微生物。乳酸菌基因表達系統(tǒng)分為組成型表達和受控表達兩種類型,其中受控表達系統(tǒng)包括糖誘導系統(tǒng)、Nisin誘導系統(tǒng)、pH誘導系統(tǒng)和噬菌體衍生系統(tǒng)。相對于乳酸乳球菌和嗜熱鏈球菌而言,德氏乳桿菌的基因研究比較缺乏,但是已經發(fā)現(xiàn)質粒pN42和PJBL2用于構建德氏乳桿菌的克隆載體。有研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌基因突變有2種方法:第一種方法涉及(同源或異源的)可獨立復制的轉座子,第二種方法是依賴于克隆的基因組DN斷和染色體上的同源部位的重組整合而獲得。通過基因工程得到的乳酸菌發(fā)酵劑具有優(yōu)良的發(fā)酵性能,產雙乙酰能力、蛋白水解能力、胞外多糖的穩(wěn)定形成能力、抗雜菌和病原菌的能力較強。
二、細胞工程技術在食品發(fā)酵生產中的應用
細胞工程是生物工程主要組成之一,出現(xiàn)于20世紀70年代末至80年代初,是在細胞水平上改變細胞的遺傳特性或通過大規(guī)模細胞培養(yǎng)以獲得人們所需物質的技術過程。細胞工程主要有細胞培養(yǎng)、細胞融合及細胞代謝物的生產等。細胞融合是在外力(誘導劑或促融劑)作用下,使兩個或兩個以上的異源(種、屬間)細胞或原生質體相互接觸,從而發(fā)生膜融合、胞質融合和核融合并形成雜種細胞的現(xiàn)象。細胞融合技術是一種改良微生物發(fā)酵菌種的有效方法,主要用于改良微生物菌種特性、提高目的產物的產量、使菌種獲得新的性狀、合成新產物等。與基因工程技術結合,使對遺傳物質進一步修飾提供了多樣的可能性。例如日本味之素公司應用細胞融合技術使產生氨基酸的短桿菌雜交,獲得比原產量高3倍的賴氨酸產生菌和蘇氨酸高產新菌株。釀酒酵母和糖化酵母的種間雜交,分離子后代中個別菌株具有糖化和發(fā)酵的雙重能力。日本國稅廳釀造試驗所用該技術獲得了優(yōu)良的高性能謝利酵母來釀制西班牙謝利白葡萄酒獲得了成功。目前,微生物細胞融合的對象已擴展到酵母、霉菌、細菌、放線菌等多種微生物的種間以至屬間,不斷培育出用于各種領域的新菌種。
三、酶工程技術在食品發(fā)酵生產中的應用
酶是活細胞產生的具有高效催化功能、高度專一性和高度受控性的一類特殊生物催化劑。酶工程是現(xiàn)代生物技術的一個重要組成部分,酶工程又稱酶反應技術,是在一定的生物反應器內,利用生物酶作為催化劑,使某些物質定向轉化的工藝技術,包括酶的研制與生產,酶和細胞或細胞器的固定化技術,酶分子的修飾改造,以及生物傳感器等。酶工程技術在發(fā)酵生產中主要用于兩個方面,一是用酶技術處理發(fā)酵原料,有利于發(fā)酵過程的進行。如啤酒釀制過程,主要原料麥芽的質量欠佳或大麥、大米等輔助原料使用量較大時,會造成淀粉酶、俘一葡聚糖酶、纖維素酶的活力不足,使糖化不充分、蛋白質降解不足,從而減慢發(fā)酵速度,影響啤酒的風味和收率。使用微生物淀粉酶、蛋白酶、一葡聚糖酶等制劑,可補充麥芽中酶活力不足的缺陷,提高麥汁的可發(fā)酵度和麥汁糖化的組分,縮短糖化時間,減少麥皮中色素、單寧等不良雜質在糖化過程中浸出,從而降低麥汁色澤。二是用酶來處理發(fā)酵菌種的代謝產物,縮短發(fā)酵過程,促進發(fā)酵風味的形成。啤酒中的雙乙酰是影響啤酒風味的主要因素,是判斷啤酒成熟的主要指標。當啤酒中雙乙酰的濃度超過閾值時,就會產生一種不愉快的餿酸味。雙乙酰是由酵母繁殖時生成的α-乙酰乳酸和α-乙酰羥基丁酸氧化脫羧而成的,一般在啤酒發(fā)酵后期還原雙乙酰需要約5～10d的時間。崔進梅等報道,發(fā)酵罐中加入α-乙酰乳酸脫羧酶能催化α-乙酰乳酸直接形成羧基丁酮,可縮短發(fā)酵周期,減少雙乙酰含量。
四、小結
在食品發(fā)酵生產中應用生物技術可以提高發(fā)酵劑的性能,縮短發(fā)酵周期,豐富發(fā)酵制品的種類。不僅提高了產品檔次和附加值,生產出符合不同消費者需要的保健制品,而且在有利于加速食品加工業(yè)的發(fā)展。隨著生化技術的日益發(fā)展,相信會開發(fā)出更多物美價廉的發(fā)酵制品,使生物加工技術在食品發(fā)酵工業(yè)中的應用更加廣泛。
參考文獻
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關鍵詞：DNA重組技術；限制酶；DNA連接酶；運載體
中圖分類號：G632 文獻標識碼：B 文章編號：1002-7661（2014）10-207-01
一、教材分析
“DNA重組技術的基本工具”是人教新課標教材選修3專題一“基因工程” 1.1的內容。本節(jié)主要介紹了DNA重組技術的三種基本工具及其作用。教材內容較為抽象，為了更好的讓學生理解DNA重組技術的三種基本工具，教材提供了較多的教學素材。例如，通過圖片的展示，讓抽象的語言在直觀的插入中找到注釋；通過模擬制作活動，讓學生在實際動手中形成正確認識；教材還采用了“生物技術資料卡”的形式，對特別名詞進行了詮釋，擴展學生的知識面。
二、教學策略
采用問題引導、小組討論的策略，構建了三個學習任務：1）限制性核酸內切酶――“分子手術刀”；2）DNA連接酶――“分子縫合針”；3）基因進入受體細胞的載體――“分子運輸車”。通過問題情境引導學生在思索中學習新知識；通過模擬操作使學生對基因工程的認識形象化；通過組內互助，鍛煉學生交流與合作的能力；通過質疑點撥及歸納交流引導學生思考，歸納總結。
三、三維目標
1）知識目標：了解基因工程的基本概念；簡述DNA重組技術所需的三種基本工具及其作用。
2）能力目標：通過分析文字材料，培養(yǎng)學生歸納總結的能力；通過學生動手操作重組DNA模型，培養(yǎng)學生的動手能力。
3）情感目標：通過小組活動，培養(yǎng)學生合作精神；通過材料分析，使學生認同基因工程的誕生和發(fā)展離不開理論研究和技術創(chuàng)新。
四、教學過程
1、復習引入
回顧：①一百年前，中國人甚至全世界人有種植抗蟲棉的嗎？②棉花本身有抗蟲基因嗎？③抗蟲基因從哪來？④培育抗蟲棉利用的是哪種育種方法？
通過層層遞進的設問，可以使學生從理性思維的角度逐漸回憶出“基因工程的概念”。從而使學生回憶起基因工程又叫做DNA重組技術，引向題目。
過渡：大家都知道DNA是非常小的，它的直徑只有我們頭發(fā)絲的十萬分之一。俗話說“工欲善其事，必先利其器”，要想把其它生物的抗蟲基因轉移到棉花細胞內，就必須要有精密的工具。那么這些工具是什么呢？
2、限制性核酸內切酶――“分子手術刀”
學習任務一: 閱讀教材“限制性核酸內切酶――‘分子手術刀’”相關內容，小組討論歸納答案：①什么是限制酶？它的來源是哪？②限制酶與我們學過的DNA 酶相同嗎？③限制酶的作用是什么？④限制酶所識別的序列有什么特點？舉例說明⑤限制酶切割的是什么鍵？⑥限制酶切割后的結果是怎樣的？舉例說明⑦什么是粘性末端？什么是平末端？兩者的區(qū)別？
以上問題，學生都可以用以前學過的知識以及書上的生物知識回答，如果遇到困難，教師可以給予適當提示與引導，使學生明確限制酶的來源、作用、特點、結果等。教師可以強調一下識別序列的規(guī)律：限制酶所識別的序列，都有中心軸線，中心軸線兩側雙鏈DNA上的堿基是反向對稱，重復排列的，稱回文序列。如圖1所示：
自學檢測：1.關于限制酶的說法正確的是A．限制酶是一種酶，只識別GAATTC堿基序列B．EcoR1切割的是G-A之間的氫鍵C．限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNAD．限制酶只存在于原核生物中質疑點撥：學生組內討論展示答案后，由組內同學進行自查自糾，如果有學生答不上來的問題，教師進行解答。如果學生沒有疑問，教師可以進行反問：如，將來源不同的DN段連接在一起，需要用同一種限制酶來切嗎？
3、DNA連接酶――“分子縫合針”
學習任務二：閱讀教材“DNA連接酶――‘分子縫合針’”相關內容，小組討論歸納答案：①什么是DNA連接酶？它與DNA聚合酶相同嗎？②DNA連接酶作用的化學鍵是什么？③DNA連接酶有哪些種類？其來源和特點分別是什么？
自學檢測：2.DNA連接酶催化的反應是A．DNA復制時母鏈與子鏈之間形成氫鍵B．粘性末端堿基之間形成氫鍵C．兩個DN段粘性末端之間的縫隙的連接D．A、B、C都不正確
質疑點撥：反問：DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？
4、基因進入受體細胞的載體――“分子運輸車”
學習任務三：閱讀教材“基因進入受體細胞的載體――‘分子運輸車’”小組討論歸納答案：①基因工程的作用是什么？②基因工程載體包括哪些？③什么叫質粒？④質粒作為載體必須滿足的條件有哪些？
自學檢測：3.下列哪項不是基因工程經常使用的，用來運載目的基因的載體
A.細菌質粒B.噬菌體C.動植物病毒D.細菌核區(qū)的DNA
質疑點撥：想一想，具備什么條件才能充當“分子運輸車”？
歸納交流：轉基因抗蟲棉的基本操作工具及其作用。
摘要生物柴油由于其燃燒性高、污染小、可再生等優(yōu)點，是傳統(tǒng)化石燃料的理想替代能源，并已在世界范圍內得到廣泛應用。基因工程技術在生物柴油中的應用，主要集中在提高生物柴油原料的脂類含量上，如對含油植物和含油微藻的研究。結合國內外主要研究進展，綜述了運用基因工程技術提高生物柴油原料脂類含量的8種途徑，如超量表達乙酰輔酶A羧化酶、脂肪酸合成酶、蘋果酸酶等。最后指出:將微藻作為生產原料是我國生物柴油產業(yè)發(fā)展的必然趨勢，通過轉錄因子途徑調控脂類的積累，是未來生物柴油產業(yè)發(fā)展的重要研究方向。
關鍵詞基因工程;生物柴油;應用;脂類含量;微藻
AbstractBiodiesel，due to its advantages of better burning performance，lower pollution，renewable feature etc.，is the ideal alternative energy source oftraditional fossil fuels and has been widely used in the world.The application of gene engineering in biodiesel production is mainly on improving the lipid content of biodiesel raw materials，such as oil plants and oil microalgae.In this paper，according to the research progress at home and abroad，the application of gene engineering in eight channels to improve the lipid content of biodiesel raw materials were reviewed.At last，it isconcluded that using microalgae as a feedstock is inevitable trend of biodiesel industry’s development in China.With the transcription factor pathway regulating lipid accumulation is an important research direction in the future development of biodiesel industry.
Key wordsgene engineering;biodiesel;application;lipid content;microalgae
社會的發(fā)展加速了人類對能源的消耗，能源問題已成為各國亟待解決的世界性問題。統(tǒng)計顯示:全球石油探明儲量僅供生產40年，這更為人類敲響了能源危機的警鐘。此外，化石能源燃燒過程中會產生大量CO2，引起的溫室效應將直接影響人類的生存環(huán)境。因此，為解決能源和環(huán)境問題，世界各國都在積極地尋找新能源，以應對將來可能發(fā)生的能源危機。生物柴油作為生物能源的一種，越來越得到各國的重視。與化石柴油相比，生物柴油具有閃點高、燃燒性高、污染小、可再生等優(yōu)點，是化石燃料的理想替代能源[1]。
生物柴油原料的油脂含量是制約生物柴油發(fā)展的一大瓶頸。運用基因工程技術，克隆并特異性表達調控脂類合成相關酶的基因，從而提高生物脂肪酸含量并改變其組分以適應生物柴油發(fā)展的需要，是目前解決這一難題的有效手段。本文結合基因工程技術的應用現(xiàn)狀，綜述了基因工程在改造生物柴油原料中的研究進展，以期對生物柴油產業(yè)的發(fā)展提供一定指導。
1基因工程概述
基因工程，又稱DNA重組技術，是指在基因水平上，以人工的方法取得目的基因，在體外重組于載體上，形成重組DNA分子，然后將重組DNA分子轉入受體細胞進行復制、轉錄和翻譯，從而產生人們所需要的目的基因的產物?；蚬こ碳夹g打破了天然物種屏障，人們可以按照主觀愿望，將來自不同生物體的DNA 片段組合到一起，并獲得新的表達產物。
基因工程技術促進了生物學的迅猛發(fā)展，為解決生命科學領域的一些重大問題提供了強有力的手段，現(xiàn)已廣泛應用于農業(yè)、醫(yī)學、食品和環(huán)境保護等諸多領域。如培育抗蟲、抗病、抗寒、抗旱農作物新品種，生產基因工程藥物和可降解有毒物質的工程菌等。同樣，在生物柴油的生產中，運用基因工程提高生物柴油原料的油脂含量，也逐步取代了傳統(tǒng)方法，并取得了顯著的效果。
2基因工程在生物柴油中的應用
生物柴油作為一種新型可再生能源，其生產原料主要為含油植物，如大豆、油菜、棕櫚和蓖麻等。此外，將含油微藻作為生物柴油原料，也在逐漸成為一個新的研究領域。用微藻生產生物柴油具有更多優(yōu)勢，繆曉玲等[2]利用小球藻生產的生物柴油，不僅具有傳統(tǒng)化石柴油相當的密度、粘度和熱值，而且具有更低的冷濾點和良好的發(fā)動機低溫啟動性能。
迄今，基因工程技術在生物柴油中的應用，主要集中在提高含油植物的脂類含量上。雖然在含油微藻方面也有一些研究，但也主要借鑒對含油植物的研究方法。下面結合國內外主要研究方向，綜述基因工程在提高生物柴油原料中脂類含量的研究進展。
2.1乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)
乙酰輔酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase，ACCase)是脂肪酸生物合成的關鍵酶，它催化脂肪酸合成的第一步反應，即催化乙酰輔酶A生成丙二酸單酰輔酶A[3-6]。生物中的ACCase有2種類型:一是異質型，存在于細菌、雙子葉植物和非禾本科單子葉植物等的質體中，由BC(生物素羧化酶)、BCCP(生物素羧基載體蛋白)、α型CT(羧基轉移酶)和β型CT(羧基轉移酶)等4個亞基組成[7-8];二是同質型，存在于動植物、酵母、藻類等的胞質溶膠中，由單亞基組成[9-12]。有研究表明，植物脂肪酸含量與ACCase的活性呈正相關。為了提高含油植物的脂肪酸含量，許多研究者進行了超量表達ACCase的試驗。其中，Roesler等將一個葉綠體轉移肽和napin啟動子與擬南芥同質型ACC1基因融合，然后轉化甘藍型油菜。結果發(fā)現(xiàn)，轉基因油菜的T1代成熟種子中ACCase的活性增加了1.7~1.9倍，總的含油量約增加了5%。由于ACCase過量表達，也改變了種子脂肪酸的組成[13]。Ohlrogge等[14]用同樣的方法轉化油菜，獲得的轉基因油菜T1代成熟種子中ACCase的活性增加了1.7~1.9倍，脂肪酸含量增加了6%。
許多學者研究了ACCase不同亞基在脂肪酸合成中的作用。Alisa等克隆和表達了油棕β-羧基轉移酶基因(accD)和生物素羧化酶基因(accC)，研究表明accD基因的表達在維持異質型ACCase的水平及植物種子的含油量中起著最重要的作用。這個研究也首次證明了高水平accD基因的表達，會產生高水平的含油量[15]。此外，Madoka等[16]、Kode等[17]分別采用超量表達和基因敲除技術方法研究了accD基因，結果顯示accD基因編碼的β-CT亞基是ACCase的限制因子。
對于含油微藻乙酰輔酶A羧化酶的研究比較少，Dunahay等[18]首次報道了含葉綠素微藻的遺傳轉化。在此試驗中，他利用硅藻的遺傳轉化系統(tǒng)，超量表達ACCase基因(acc1)，初步結果顯示，轉基因硅藻中ACCase的活性增加了2~3倍。
2.2脂肪酸合成酶(FAS)
脂肪酸合成過程中，乙酰輔酶A經乙酰輔酶A羧化酶催化轉變?yōu)楸］o酶A后，脂肪酸合成酶(FAS)就以丙二酰輔酶A為底物，繼續(xù)進行脂肪酸的合成[19]。在植物中，F(xiàn)AS由ACP(酰基載體蛋白)和其他6種酶構成。其中，Dehesh等克隆了編碼菠菜酮酰-ACP合酶(KASⅢ)的cDNA基因，使其在煙草、擬南芥和橄欖型油菜中超量表達。結果與正常植株相比，飽和脂肪酸(16∶0)都有所增加，不飽和脂肪酸含量下降[20]。
2.3?；o酶A:甘油二酯?；D移酶(DGAT)
?；o酶A:甘油二酯?；D移酶(acyl CoA:diacylgy-cerol acyltransferase，DGAT)是一種完整的內質網細胞微粒體酶，是催化三酰甘油(triacylgycerol，TAG)合成的最后一步反應的酶，也是甘油三酯合成過程中唯一的關鍵酶和限速酶。該酶的主要作用機制是使二酰甘油(diacylgycerol，DAG)加上脂肪酸?；o酶A形成三酰甘油[21-24]。Jako等首次在野生型擬南芥中，超量表達了種子特異性DGAT的cDNA，結果DGAT的活性增加了10%~70%，種子含油量也有顯著增加[25]。Zhang等構建了特異hpRNA(具發(fā)夾結構的雙鏈RNA)，用它沉默煙草內源性DGAT1基因，轉基因植株的成熟種子含油量下降了9%~49%[26]。
2.4乙酰輔酶A合成酶(ACS)
乙酰輔酶A合成酶不可逆的催化醋酸形成乙酰輔酶A，而乙酰輔酶A可以為脂類的合成提供原料。Roughan等發(fā)現(xiàn)乙酰輔酶A合成酶可以將醋酸轉化為乙酰輔酶A，并進入脂類合成途徑[27]。Lin等在大腸桿菌體內超量表達了其自身乙酰輔酶A合成酶基因(acs)，與對照組相比，乙酰輔酶A合成酶的活性增加了9倍，同時也加速了脂類的生物合成[28]。
2.5ATP-檸檬酸裂解酶(ACL)
ATP-檸檬酸裂解酶催化檸檬酸形成乙酰輔酶A和草酰乙酸，乙酰輔酶A可以為脂類的合成提供原料。Ratledge等研究了ACL的活性與甘藍型油菜種子脂質積累的關系，發(fā)現(xiàn)在種子快速合成脂質過程中，ACL和乙酰輔酶A羧化酶一樣，其活性達到最大[29]。Rangasamy等研究了老鼠肝臟ACL基因在煙草質體中的異源超量表達，結果表明超量表達老鼠ACL基因，使煙草質體中總ACL活性增加了4倍，脂肪酸的合成也增加了16%[30]。
2.6蘋果酸酶(ME)
蘋果酸酶以NADP+為輔酶，催化蘋果酸脫氫產生丙酮酸和NADPH，NADPH可用為脂肪酸合成中的還原反應。于是有人提出通過超量表達蘋果酸酶，為脂肪酸合成提供充足的還原動力，從而達到提高脂肪酸含量的目的。Wynn等[31]發(fā)現(xiàn)蘋果酸酶為構巢曲霉(Aspergillus nidulans)的脂質積累提供主要的還原動力NADPH。隨后，Wynn等又進一步研究了NADPH與脂質積累之間的關系。即在絲狀真菌中超量表達蘋果酸酶，結果有大量NADPH生成，為脂類的合成提供了充足的還原動力，同時也增加了脂質的積累[32]。Zhang等在卷枝毛霉(Mucor circinelloides)中超量表達了蘋果酸酶，結果發(fā)現(xiàn)蘋果酸酶的活性增加了2~3倍，同時脂質的生物合成也增加了2.5倍[33]。
2.7β-氧化途徑
脂肪酸的β-氧化途徑，是生物體內脂肪酸降解的主要途徑，它發(fā)生于原核生物的細胞溶膠及真核生物的線粒體基質中。因此，有研究者提出限制脂肪酸β-氧化途徑的發(fā)生來提高含油植物的脂類含量。其中，Hara等用念珠菌研究了β-氧化途徑中的關鍵酶——?；o酶A氧化酶，阻斷對該酶所有基因的編碼，并希望能增加二羧酸的生成。但結果相反，重組體念珠菌不能利用烷烴，也不能生產二羧酸[34]。由于直接對β-氧化途徑關鍵酶的研究有一定的局限性，Cao等從酯酰輔酶A跨膜轉運的角度，對提高念珠菌二羧酸生成進行了研究。在其研究中，通過對肉堿-酯酰轉移酶(CAT)基因在重組體中的特異表達，發(fā)現(xiàn)當CAT的活性減少1/2時，二羧酸的產率增加了21.0%，對烷烴的轉化能力增加了12.0%。但是，如果將CAT基因全部敲除，則重組體不能利用烷烴生產二羧酸[35]。
2.8磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPase)
許多研究者發(fā)現(xiàn)油菜蛋白質含量與油脂含量呈負相關，于是有人提出對應的反義技術調控植物油脂含量。陳錦清等[36]提出油脂和蛋白質的“底物競爭”假說，認為葡萄糖酵解產物——丙酮酸是油脂和蛋白質合成的共同底物，2種物質在合成中競爭丙酮酸。乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)和丙酮酸羧化酶(PEPCase)分別是這2種物質合成的關鍵酶，它們的相對活性就決定了丙酮酸的流向。在這項研究中，他將根癌農桿菌EHA101攜帶反義PEP基因，然后轉化甘藍型油菜——浙油758和浙優(yōu)油1號的下胚軸，成功地獲得了轉基因植株。對浙油758轉基因植株的含油量測定顯示，種子平均含油量比對照組高6.4%。對浙優(yōu)油1號轉基因植株的油脂及蛋白質含量測定表明，種子平均含油量比對照組高16.7%，其中1株油菜蛋白質含量下降9.7%。對轉基因植株及對照組種子的油脂和蛋白質含量進行回歸分析表明，2種植株的油脂和蛋白質含量呈顯著負相關。張銀波等構建了PEP基因的RNAi載體，希望通過抑制蛋白質的合成以使丙酮酸轉向油脂的合成。由于RNAi技術的有效性及簡易性，若該載體成功實現(xiàn)抑制目的基因，則可以為高油作物的培育開辟新的途徑[37]。微藻PEPase的研究借鑒對含油植物的研究方法，其中宋東輝等采用反義PEP技術調控微藻PEPase的代謝途徑，初步結果顯示，反義抑制PEPase酶活性可以顯著提高微藻脂類含量[1]。
3結語
生物柴油具有可再生、污染小、燃燒性高等優(yōu)點，是一種新型環(huán)?？稍偕茉?，具有極廣闊的應用前景。目前，世界生物柴油的生產原料主要為含油植物，但根據我國食用油尚需大量進口的情況，不可能將植物油大規(guī)模用于生產生物柴油。而且我國土地資源有限，大幅度增加含油植物種植面積難度很大。因此，若要大規(guī)模發(fā)展我國生物柴油產業(yè)，必須尋找其他的生物柴油原料。利用微藻生產生物柴油可以很好地解決上述問題。微藻生長周期短，生長速率快，光合作用效率高，而且不占用農業(yè)用地，可以利用微生物發(fā)酵技術，在光反應器中高密度培養(yǎng)。因此，將微藻作為生產原料是我國生物柴油產業(yè)發(fā)展的必然趨勢。
目前，國內外運用基因工程技術生產生物柴油還處于初級階段，多采用單基因的特異表達提高脂類含量水平。但脂類的積累涉及到脂類的生物合成及分解代謝，是一個復雜的系統(tǒng)，不可能通過特異的表達一種基因來大大提高脂類含量。針對以上問題，已有學者提出轉錄因子途徑調控脂類的積累。該途徑的主要優(yōu)勢在于，轉錄因子參與調控代謝途徑中的一系列基因。因此，可以通過調控相關轉錄因子，進而帶動代謝途徑中的一系列基因超量表達，使脂類水平大大提高。
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知識點一、大腸桿菌在分類上屬于細菌，原核微生物。
例題一：下列生物中，均由真核細胞組成的一組生物是（ ）
A、小麥、大腸桿菌 B、酵母菌、蝗蟲
C、藍藻、團藻 D、人、流感病毒
解析：流感病毒為非細胞型生物，大腸桿菌和藍藻為原核生物。小麥、酵母菌、蝗蟲、團藻、人是真核細胞構成的真核生物。故答案為B。
知識點二、大腸桿菌的新陳代謝類型為異養(yǎng)厭氧型。
例題二：下列微生物的新陳代謝類型屬于異養(yǎng)厭氧型的生物是（ ）
A、根瘤菌 B、圓褐固氮菌 C、大腸桿菌 D、反硝化細菌
解析：根瘤菌、圓褐固氮菌的新陳代謝類型是異養(yǎng)需氧型，大腸桿菌的新陳代謝類型是異養(yǎng)厭氧型，反硝化細菌在缺氧環(huán)境中可以將硝酸鹽轉化為亞硝酸鹽并最終轉化為氮氣，其新陳代謝類型是異養(yǎng)厭氧型。故答案為C 、D。
知識點三、大腸桿菌在生態(tài)系統(tǒng)中的地位：在生態(tài)系統(tǒng)中能夠將動植物的遺體、排出物和殘落物中所含的有機物，逐漸分解成無機物，歸還到無機環(huán)境中，被綠色植物重新利用，所以屬于生態(tài)系統(tǒng)中的分解者。
例題三：下列微生物中屬于分解者的是（ ）
A、根瘤菌 B、藍藻 C、大腸桿菌 D、硝化細菌
解析：根瘤菌與豆科植物互利共生，是消費者。藍藻是光能自養(yǎng)型生物，硝化細菌是化能自養(yǎng)型生物，都屬于生產者。只有大腸桿菌是分解者。故答案為C.
知識點四、大腸桿菌的細胞結構
大腸桿菌為原核細胞構成，結構比較簡單，與真核細胞相比，最主要的特點是沒有核膜包圍的典型的細胞核。細胞表面有一層堅固的細胞壁，主要成分是由糖類與蛋白質結合而成的化合物，細胞膜的化學組成和結構與真核細胞相似，細胞質內沒有高爾基體、線粒體、內質網和葉綠體等復雜的細胞器，有分散的核糖體、質粒，細胞內含有絲狀的區(qū)域叫做擬核，DNA分子上不含有蛋白質成分，所以沒有真核細胞所具有的染色體。特殊結構有莢膜、鞭毛和芽孢。
例題四： 大腸桿菌在生長時，細胞內鉀離子的質量分數是培養(yǎng)液的3000倍。如果在培養(yǎng)液中加入不影響細胞呼吸作用的藥物，大腸桿菌細胞內鉀離子的質量分數立即下降，這種藥物的作用是（ ）
A、破壞了線粒體的結構 B、抑制了細胞內呼吸酶的活性
C、破壞了細胞內的遺傳物質 D、抑制了細胞膜上載體的活性
解析： 大腸桿菌為原核生物，細胞內無線粒體。鉀離子是通過主動運輸被吸收的。此藥物不影響呼吸作用，則ATP可正常合成，所以只考慮載體的情況。故答案為D。
知識點五、大腸桿菌的遺傳物質和基因結構：大腸桿菌為原核細胞構成，其擬核中有一個大型的環(huán)狀DNA分子，控制著大腸桿菌的主要遺傳性狀，細胞質中含有質粒，質粒上面含有幾個到幾百個基因，控制著大腸桿菌的抗藥性、固氮、抗生素生成等性狀。構成大腸桿菌的基因是由成百上千個核苷酸對組成的，包括能夠編碼蛋白質的編碼區(qū)和編碼區(qū)上游和下游不能編碼蛋白質的非編碼區(qū)，編碼區(qū)是連續(xù)的，不間隔的。
例題五：下列有關大腸桿菌遺傳物質的敘述正確的是（ ）
A、大腸桿菌只有擬核中含有遺傳物質
B、大腸桿菌的基因中只有外顯子，沒有內含子
C、大腸桿菌基因結構中的非編碼序列是位于編碼區(qū)上游和下游的核苷酸序列
D、大腸桿菌基因結構中的非編碼序列是位于編碼區(qū)上游和下游的核苷酸序列和編碼區(qū)中的內含子
解析：大腸桿菌為原核細胞構成，其擬核和質粒中都有基因，原核細胞基因是連續(xù)的，不間隔的，無外顯子和內含子之分。故答案為C。
知識點六、大腸桿菌在基因工程中的作用：在基因工程中大腸桿菌可作為受體細胞，細胞中的質?？梢宰鳛檫\輸目的基因的運載體。例如：將大腸桿菌的質粒取出，連接上人生長激素基因后，重新置入大腸桿菌的細胞內，然后，用這種帶有人生長激素基因的工程菌進行發(fā)酵，就能得到大量的人生長激素。
例題六：1979年，科學家將動物體內能夠產生胰島素的基因與大腸桿菌的DNA重組并且在大腸桿菌內表達獲得成功。下列有關說法錯誤的是（ ）
A、胰島素基因和大腸桿菌的DNA重組時，需要DNA連接酶
B、通常用一種限制性內切酶處理人的胰島素基因，用另一種酶處理大腸桿菌的質粒DNA
C、檢測胰島素基因是否進入了大腸桿菌，通常根據受體細胞是否具有質粒特有的某種抗性來確定
D、將胰島素基因導入大腸桿菌后，由于大腸桿菌繁殖的速度非常快，因此在短時間內就能獲得大量的胰島素
解析：基因工程中要用同一種限制性內切酶切取目的基因和運載體，以露出相同的黏性末端，兩者的黏性末端黏合時，需要DNA連接酶。作為運載體，大腸桿菌的質粒要具有標記基因。大腸桿菌為原核生物，體積小，繁殖速度快，在發(fā)酵工程中被廣泛應用。故答案為B。
知識點七、大腸桿菌的鑒定：在微生物培養(yǎng)基中加入伊紅和美蘭，如果有大腸桿菌，其代謝產物（有機酸）就與
伊紅和美蘭結合，使菌落呈深紫色，并帶有金屬光澤。
例題七：如果大腸桿菌和圓褐固氮菌混合，采用下列哪組培養(yǎng)基可將大腸桿菌鑒別，將圓褐固氮菌分離（ ）
A、無氮培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 B、加食鹽培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基
C、加青霉素培養(yǎng)基和伊紅-美蘭培養(yǎng)基 D、伊紅-美蘭培養(yǎng)基和無氮培養(yǎng)基
關鍵詞：限制酶 篩選
一、單酶切及篩選
若用同一種限制酶切割質粒和目的基因形成相同的四個黏性末端，因而可能出現(xiàn)多種連接方式如：①質粒和質粒；②目的基因和目的基因；③質粒的自身環(huán)化，目的基因的自身連接；④質粒與目的基因的連接。質粒與目的基因的連接又會出現(xiàn)正向連接和反向連接兩種。若啟動子在質粒上，目的基因與質粒的反向連接則導致三聯(lián)體密碼順序改變，起始密碼子和終止密碼子位置改變，使得翻譯不能正常進行而無法得到正常的表達產物。
例1： （2012江蘇生物高考33題部分）圖2表示一種質粒的結構和部分堿基序列?，F(xiàn)有Msp I、BamH I、Mbo I、Sma I4種限制性核酸內切酶，它們識別的堿基序列和酶切位點分別為CCGG、GGATCC、GATC、CCCGGG。請回答下列問題。
■
若將圖2中質粒和目的基因D通過同種限制酶處理后進行連接，形成重組質粒，那么應選用的限制酶是 。在導入重組質粒后，為了篩選出含重組質粒的大腸桿菌，一般需要用添加 的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。經檢測，部分含有重組質粒的大腸桿菌菌株中目的基因D不能正確表達，其最可能的原因是 。答案： BamH I，抗生素B，同種限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D與質粒反向鏈接。
筆者認為可通過免疫學方法檢測目的基因的表達產物排除反向連接的重組質粒，或分別在質粒和目的基因上設計相同的限制酶識別位點，然后用該酶去切割重組質粒，正向連接和反向連接便會得到不同長度的DN段，再根據已知的限制酶在目的基因的位置進行比對，找到正確連接的重組質粒。
二、雙酶切及篩選
因為用單酶切會出現(xiàn)質粒與目的基因的任意連接，所以在實際操作中多使用雙酶切。雙酶切可以避免質粒的自身環(huán)化，目的基因的自身連接和目的基因和質粒的反向連接，而目的基因與目的基因的連接因為沒有抗生素抗性基因所以可以在含有該抗生素的培養(yǎng)基上去除，故只剩下質粒與質粒，以及質粒與目的基因的重組體。
（一）插入失活篩選法
例2：（蘇錫常鎮(zhèn)2012屆高三教學調研測試）MseI，EcoRI，PstI識別的堿基序列和切割位點分別為GAATTAATTC，GAATTC，CTGCAG。請回答下列問題：
（1）在用圖中的質粒和外源DNA構建重組質粒時，需要對質粒改造，構建新的限制酶切位點。試寫出構建需要的限制酶切位點的過程（提供構建需要的所有條件）：
①首先用 酶處理質粒；
②然后用DNA聚合酶等處理質粒；
③再運用 酶處理質粒，從而形成新的限制酶切位點，可被 酶識別。
（2）基因工程中的檢測篩選是一個重要的步驟。下圖表示運用影印培養(yǎng)法（使在一系列培養(yǎng)皿的相同位置上能出現(xiàn)相同菌落的一種接種培養(yǎng)方法）檢測基因表達載體是否導入大腸桿菌。
■■
圖3
培養(yǎng)基除了含有細菌生長繁殖必需的成分外，培養(yǎng)基A和培養(yǎng)基B分別還含有 ，
。從檢測篩選的結果分析，含有目的基因的是 菌落中的細菌。答案：（1）EcoRI，DNA連接，MseI（2）四環(huán)素 青霉素（四環(huán)素和青霉素）4和6
用限制酶MseI和 PstI同時切割含目的基因的DNA和質粒，但原有質粒上無MseI識別位點，需利用EcoRI識別位點重新構建MseI識別位點。
在抗青霉素基因內部具有重新構建的MseI識別位點，當用MseI和Pst I同時切割含目的基因的外源DNA和質粒，由于目的基因的插入，導致抗青霉素基因出現(xiàn)功能性失活，于是所形成的重組質粒都將具有四環(huán)素抗性和對青霉素敏感。將轉化的細菌接種在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上，一段時間后可得到全部受體菌菌落，將滅菌的絨布按到培養(yǎng)基上，使絨布面沾上菌落，然后將絨布按到含青霉素的培養(yǎng)基上。含重組質粒的受體菌能在四環(huán)素培養(yǎng)基上生長卻無法在青霉素培養(yǎng)基上上生長。上題實際是運用插入失活效應檢測外源DNA。
根據插入失活原理設計的篩選重組體分子的方法，需要進行菌落平板的影印復制，才能識別出由此而喪失的表型特征，這會給重組體的篩選工作增加不少麻煩，由此而發(fā)展出β-半乳糖苷酶顯色反應選擇法。
（二）β-半乳糖苷酶顯色篩選法
例3：（鹽城市2012屆高三二模）大腸桿菌pUCl8質粒上的LacZ基囚可表達出β-半乳糖苷酶，當培養(yǎng)基中含有IPTG和X-gal時，X-gal便會被β-半乳糖苷酶水解成藍色，大腸桿菌將形成藍色菌落；反之，則形成白色菌落。由此推知，選擇培養(yǎng)基中除含有大腸桿菌必需的葡萄糖、氮源、無機鹽、水、生長因子等營養(yǎng)物質外，還應加入 物質。成功導人重組質粒的大腸桿菌在培養(yǎng)基中形成 色的菌落，原因是 。
■
圖四
選擇培養(yǎng)基中除含有大腸桿菌必需的葡萄糖、氮源、無機鹽、水、生長因子等營養(yǎng)物質外，還應加入IPTG，X-gal和氨芐青霉素。只有導入質粒的大腸桿菌才能在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長繁殖，而重組質粒中的LacZ基囚因插入目的基因不能正常表達，所以無法表達β-半乳糖苷酶，培養(yǎng)基呈白色。答案：IPTG X-gal 氨芐青霉素：白色；重組質粒中的LacZ基因因插入目的基因而不能表達。
三、平端位點問題
構建重組質粒時常會出現(xiàn)平端位點，平端DNA可用T4DNA連接酶連接，平端連接可使載體和外源DNA連接序列上的原有限制位點消失，而不含外源插入DNA的載體，經自連成環(huán)后仍保留原有的限制位點。基于這一特性，使用特定限制酶處理連接混合物將能專一性地使自連載體DNA線性化，能抗酶解的重組DNA則依然保持環(huán)狀。
參考文獻：
關鍵詞:生化技術;發(fā)酵工程;食品；應用
在我國的食品生產工業(yè)中,生化技術工業(yè)化產品占有相當大的比重。隨著酒類和新型發(fā)酵產品以及釀造產品的產值在食品工業(yè)總產值的比重不斷提升，現(xiàn)代生化技術在食品發(fā)酵工程中的應用有著廣闊的發(fā)展前景。
一、食品生化技術和發(fā)酵工程簡介
食品生化技術是現(xiàn)代生物技術在食品領域中的應用，是指以現(xiàn)代生命科學的研究成果為基礎，結合現(xiàn)代工程技術手段和其他學科的研究成果，用全新的方法和手段設計新型的食品和食品原料。廣義的食品生化技術包括在食品加工制造上的所有生物技術，涉及到基因工程（是生物技術的核心與基礎）、細胞工程、發(fā)酵工程、酶工程以及生物工程下游技術（包括提取和純化技術等）和現(xiàn)代分子檢測技術。食品生物技術涵蓋分子生物學、細胞生物學、免疫學、生理學、遺傳學、生物化學、微生物學、生物物理學、食品營養(yǎng)學、毒理學等生物類學科，同時涉及信息學、電子學、化學等學科，是一門多學科相互滲透的綜合性學科。
現(xiàn)代生物技術的迅猛發(fā)展,成就非凡,推動著科學的進步,促進著經濟的發(fā)展,改變著人類的生活與思維,影響著人類社會的發(fā)展進程。現(xiàn)代生物技術的成果越來越廣泛地應用于醫(yī)藥、食品、能源、化工、輕工和環(huán)境保護等諸多領域。生物技術是21世紀高新技術革命的核心內容,具有巨大的經濟效益及潛在的生產力。專家預測,到2010～2020年,生物技術產業(yè)將逐步成為世界經濟體系的支柱產業(yè)之一。
發(fā)酵工程是指采用現(xiàn)代工程技術手段，利用微生物的某些特定功能，為人類生產有用的產品，或直接把微生物應用于工業(yè)生產過程的一種新技術。發(fā)酵工程的內容包括菌種的選育、培養(yǎng)基的配制、滅菌、擴大培養(yǎng)和接種、發(fā)酵過程和產品的分離提純等方面。
二、食品生化技術在發(fā)酵工業(yè)的應用
（一）、基因技術在食品發(fā)酵工程中的應用
基因技術在現(xiàn)代生化技術中占有重要的地位,主要采用類似工程設計的方法,按照不同的需求將目的基因剪切、組合、拼接,再將人工重組的基因通過載體導入受體細胞,進行無性繁殖,并使目的基因在受體細胞中高速發(fā)展,產生出人類所需要的產品或組建成新的生物類型。基因技術在食品發(fā)酵工程中主要有以下應用:
1、改良釀酒酵母菌的性能
利用基因工程技術培育出新的釀酒酵母菌株,用以改進傳統(tǒng)的釀酒工藝,并使之多樣化。采用基因工程技術將大麥中的淀粉酶基因轉入啤酒酵母中后,即可直接利用淀粉發(fā)酵,使生產流程縮短,工序簡化,革新啤酒生產工藝。目前,已成功地選育出分解β-葡聚糖和分解糊精的啤酒酵母菌株、嗜殺啤酒酵母菌株,提高生香物質含量的啤酒酵母菌株。
2、改良面包酵母菌的性能
將優(yōu)良酶基因轉入面包酵母菌中后,其含有的麥芽糖透性酶及麥芽糖的含量比普通面包酵母顯著提高,面包加工中產生二氧化碳氣體量提高,應用改良后的酵母菌種可生產出膨潤松軟的面包。
3、 改良乳酸菌發(fā)酵劑的性能
乳酸菌能代謝產生乳酸,降低發(fā)酵產品pH值。乳酸菌基因表達系統(tǒng)分為組成型表達和受控表達兩種類型,其中受控表達系統(tǒng)包括糖誘導系統(tǒng)、Nisin誘導系統(tǒng)、pH 誘導系統(tǒng)和噬菌體衍生系統(tǒng)。相對于乳酸乳球菌和嗜熱鏈球菌而言,德氏乳桿菌的基因研究比較缺乏,但是已經發(fā)現(xiàn)質粒pN42和PJBL2用于構建德氏乳桿菌的克隆載體。有研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌基因突變有2種方法:第一種方法涉及(同源或異源的)可獨立復制的轉座子,第二種方法是依賴于克隆的基因組DNA 片斷和染色體上的同源部位的重組整合而獲得。通過基因工程得到的乳酸菌發(fā)酵劑具有優(yōu)良的發(fā)酵性能,產雙乙酰能力、蛋白水解能力、胞外多糖的穩(wěn)定形成能力、抗雜菌和病原菌的能力較強。
（二）細胞工程技術在食品發(fā)酵生產中的應用
細胞工程是生物工程主要組成之一,出現(xiàn)于20世紀70年代末至80 年代初,是在細胞水平上改變細胞的遺傳特性或通過大規(guī)模細胞培養(yǎng)以獲得人們所需物質的技術過程。細胞工程主要有細胞培養(yǎng)、細胞融合及細胞代謝物的生產等。細胞融合是在外力(誘導劑或促融劑)作用下,使兩個或兩個以上的異源(種、屬間) 細胞或原生質體相互接觸,從而發(fā)生膜融合、胞質融合和核融合并形成雜種細胞的現(xiàn)象。細胞融合技術是一種改良微生物發(fā)酵菌種的有效方法,主要用于改良微生物菌種特性、提高目的產物的產量、使菌種獲得新的性狀、合成新產物等。與基因工程技術結合,使對遺傳物質進一步修飾提供了多樣的可能性。例如日本味之素公司應用細胞融合技術使產生氨基酸的短桿菌雜交,獲得比原產量高3倍的賴氨酸產生菌和蘇氨酸高產新菌株。釀酒酵母和糖化酵母的種間雜交,分離子后代中個別菌株具有糖化和發(fā)酵的雙重能力。日本國稅廳釀造試驗所用該技術獲得了優(yōu)良的高性能謝利酵母來釀制西班牙謝利白葡萄酒獲得了成功。目前,微生物細胞融合的對象已擴展到酵母、霉菌、細菌、放線菌等多種微生物的種間以至屬間,不斷培育出用于各種領域的新菌種。
（三）酶在食品發(fā)酵生產中的應用
酶是活細胞產生的具有高效催化功能、高度專一性和高度受控性的一類特殊生物催化劑。酶工程是現(xiàn)代生物技術的一個重要組成部分,酶工程又稱酶反應技術,是在一定的生物反應器內,利用生物酶作為催化劑,使某些物質定向轉化的工藝技術,包括酶的研制與生產,酶和細胞或細胞器的固定化技術,酶分子的修飾改造,以及生物傳感器等。酶工程技術在發(fā)酵生產中主要用于兩個方面,一是用酶技術處理發(fā)酵原料,有利于發(fā)酵過程的進行。如啤酒釀制過程,主要原料麥芽的質量欠佳或大麥、大米等輔助原料使用量較大時,會造成淀粉酶、俘一葡聚糖酶、纖維素酶的活力不足,使糖化不充分、蛋白質降解不足,從而減慢發(fā)酵速度,影響啤酒的風味和收率。使用微生物淀粉酶、蛋白酶、一葡聚糖酶等制劑,可補充麥芽中酶活力不足的缺陷,提高麥汁的可發(fā)酵度和麥汁糖化的組分,縮短糖化時間,減少麥皮中色素、單寧等不良雜質在糖化過程中浸出,從而降低麥汁色澤。二是用酶來處理發(fā)酵菌種的代謝產物,縮短發(fā)酵過程,促進發(fā)酵風味的形成。啤酒中的雙乙酰是影響啤酒風味的主要因素,是判斷啤酒成熟的主要指標。當啤酒中雙乙酰的濃度超過閾值時,就會產生一種不愉快的餿酸味。雙乙酰是由酵母繁殖時生成的α-乙酰乳酸和α-乙酰羥基丁酸氧化脫羧而成的,一般在啤酒發(fā)酵后期還原雙乙酰需要約5～10d 的時間。崔進梅等報道,發(fā)酵罐中加入α-乙酰乳酸脫羧酶能催化α-乙酰乳酸直接形成羧基丁酮,可縮短發(fā)酵周期,減少雙乙酰含量。
三、小結
應用生物技術可以提高發(fā)酵劑的性能,縮短發(fā)酵周期,豐富發(fā)酵制品的種類。不僅提高了產品檔次和附加值,生產出符合不同消費者需要的保健制品,而且在有利于加速食品加工業(yè)的發(fā)展。隨著生化技術的日益發(fā)展,相信會開發(fā)出更多物美價廉的發(fā)酵制品,使生物加工技術在食品發(fā)酵工業(yè)中的應用更加廣泛。
參考文獻
[1] 徐成勇,郭本恒等.酸奶發(fā)酵劑和乳酸菌生物技術育種[J].中國生物工程雜志.2004,(7):27.
CC.ATP含有兩個高能磷酸鍵，腺嘌呤核糖核苷酸含有一個高能磷酸鍵，mRNA無高能磷酸鍵DD.腺嘌呤核糖核苷酸是mRNA的單體之一，ATP去掉遠離腺苷的兩個磷酸基團后的剩余部分就是腺嘌呤核糖核苷酸分值: 6分 查看題目解析 >22.下列關于細胞結構和功能的敘述錯誤的是()AT2噬菌體的外殼在宿主細胞的核糖體上合成B生態(tài)系統(tǒng)的生產者的細胞中均無中心體C線粒體內膜上和類囊體膜上均附著催化ATP合成酶D細胞核是細胞的代謝中心，但并非所有細胞中都有細胞核分值: 6分 查看題目解析 >33.在蛋白質合成過程中，肽酰轉移酶催化核糖體上一個氨基酸的氨基與另一個氨基酸的羧基間形成肽鍵。該酶對核糖核酸酶敏感，但對蛋白酶不敏感。下列關于肽酰轉移酶的敘述錯誤的是（）A肽酰轉移酶在核糖體上合成
B肽酰轉移酶在核糖體中起作用C肽酰轉移酶催化氨基酸脫水縮合D肽酰轉移酶能降低反應的活化能分值: 6分 查看題目解析 >44.下列對某二倍體生物（2n=16）中進行的正常的減數分裂過程的敘述，錯誤的是()A間期結束時細胞中的核DNA數目增加一倍B姐妹染色單體消失時的細胞中不存在同源染色體
C分裂過程中一定出現(xiàn)同源染色體的分離D分裂過程中可能會出現(xiàn)姐妹染色單體之間的交叉互換分值: 6分 查看題目解析 >55.研究人員在豌豆的細胞中發(fā)現(xiàn)了如下圖所示的4種變異類型，下列有關說法正確的是()
A甲、乙、丁均屬于染色體結構變異
B甲、乙、丙均展示了聯(lián)會時期的染色體形態(tài)特征C若不考慮其他染色體，乙、丙經減數分裂最多均能形成2種配子D變異甲、乙、丙并沒有改變基因的種類與數量，因此不會導致生物性狀改變分值: 6分 查看題目解析 >66.生物學是一門實驗科學，下列關于實驗①②③④的說法中，正確的是（）①探究低溫對植物染色體數目變異的影響 ②用高倍鏡觀察葉綠體和線粒體③觀察根尖分生組織細胞的有絲分裂 ④觀察DNA和RNA在細胞中的分布A上述4個實驗都用到光學顯微鏡B實驗②④中，都用甲基綠作為染色劑，且甲基綠為活性染色劑C實驗①③均可使用體積分數為95%的酒精，只是實驗①在使用時還需加入適量的無水碳酸鈉出去酒精中的水分D實驗③④均用到了鹽酸，其作用是改變細胞膜的通透性，加速染色劑進入細胞，同時使染色體中的DNA和蛋白質分離，有利于染色分值: 6分 查看題目解析 >簡答題（綜合題） 本大題共69分。簡答應寫出文字說明、證明過程或演算步驟。7已知K+有增強植物體對糖類等有機物運輸的能力。為探究無土栽培油菜的光合作用的最適K+濃度和最適溫度，某同學在溫室中做了以下5組實驗，除表格所給條件外，其他條件均適宜。于中午12:30測定各組葉片的光合速率，各組實驗處理及結果如下表所示：
（注：每組實驗均重復10次，實驗數據求平均值）回答下列問題：29.為探究無土栽培油菜光合作用的最適K+濃度，該實驗的無關變量有 （寫出3個）。30.最適濃度的K+，可以 ，從而提高光合速率。31.根據上述實驗結果，能否判斷無土栽培油菜光合作用的最適K+濃度？為什么？32.根據上述實驗結果，能否判斷無土栽培油菜光合作用的最適溫度？為什么？分值: 12分 查看題目解析 >8科學實驗證實，抽取人體扁桃體中的干細胞可以用來修復受損的肝臟器官。請回答下列問題：
33.人體扁桃體干細胞中有23對同源染色體，甲圖表示干細胞修復受損的肝臟器官的過程中，細胞中某種物質隨時間的變化曲線，請寫出甲圖的縱坐標代表的內容 。34.受損的肝臟細胞中存在部分死亡細胞，其中因肝臟受損導致細胞的死亡稱 ，而被病原體感染的細胞被效應T細胞攻擊的死亡稱 。35.干細胞內不存在轉氨酶（肝臟細胞內特有）的原因是 。36.圖乙a、b、c中表示染色單體的是 ，理由是 。分值: 7分 查看題目解析 >9豌豆的抗病對感病為顯性，高莖對矮莖為顯性，兩對性狀獨立遺傳?，F(xiàn)有天然感病矮莖和抗病高莖兩品種的豌豆種子，欲培育純合的抗病矮莖品種。請回答：37.若采用雜交育種的方法培育抗病矮莖新品種，需對母本進行 （寫出3種操作）等處理，以進行人工雜交．雜交育種所依據的遺傳學原理是，其過程可通過將上述兩個親本雜交，在F2中選擇表現(xiàn)型為 的個體，再經連續(xù)自交和 等手段，最后得到穩(wěn)定遺傳的抗病矮莖新品種。38.采用誘變育種的方法也可以獲得純合的抗病矮莖品種。在用γ射線誘變時，需要處理大量種子，其原因是基因突變具有 、 等特點。39.若采用單倍體育種，需采用 方法獲得單倍體植株，然后用人工誘導的方法處理單倍體幼苗，使 。單倍體育種涉及的原理主要有 。其優(yōu)點是 ，且獲得的二倍體為 。分值: 10分 查看題目解析 >10在一群羽毛為藍色的鳥中，偶然發(fā)現(xiàn)一只灰紅色羽的雌鳥，欲探究該種鳥羽毛眼色的遺傳方式，實驗設計如下，用該灰紅色羽雌鳥與藍色羽雄鳥。（已知鳥類的性別決定為ZW型，即ZZ表現(xiàn)為雄性，ZW表現(xiàn)為雌性）40.若F1的性狀表現(xiàn)為灰紅色羽：藍色羽=1:1，且雌鳥、雄鳥個體中兩種性狀均有，則此突變基因位于是 （常、Z、W）染色體上，親本灰紅色羽雌鳥的變異類型是 （顯性、隱性）基因突變。41.若F1的性狀表現(xiàn)為灰紅色羽雄鳥：藍色羽雌鳥=1:1，則此突變基因位于是 （常、Z、W）染色體上，親本灰紅色羽雌鳥的變異類型是 （顯性、隱性）基因突變。此條件下， （能，不能）通過雜交實驗判斷突變基因所在染色體的同源染色體上是否含有控制羽毛顏色的基因，原因是 。42.若F1的性狀表現(xiàn)為灰紅色羽雌鳥：藍色羽雄鳥=1:1，則此突變基因位于是 （常、Z、W）染色體上，親本灰紅色羽雌鳥的變異類型是 （顯性、隱性）基因突變。分值: 10分 查看題目解析 >11某些微生物能合成纖維素酶，通過對這些微生物的研究，人們能夠利用秸稈等廢棄物生產酒精，用纖維素酶處理服裝面料等。研究人員用化合物A、硝酸鹽、磷酸鹽以及微量元素配置的培養(yǎng)基，成功地篩選到能產生纖維素酶的微生物。請分析并回答問題：43.培養(yǎng)基中加入的化合物A是 ，為微生物的生長提供碳源，這種培養(yǎng)基屬于 培養(yǎng)基，配置培養(yǎng)基過程中常用的滅菌法為 。44.在篩選纖維素分解菌的過程中，通常用 染色法，如果培養(yǎng)基某部位出現(xiàn) 現(xiàn)象則說明存在纖維素分解菌。45.一同學在純化該類生物時，發(fā)現(xiàn)涂布的培養(yǎng)基上菌落連成一片，最可能的原因是 ，應該采取 措施避免出現(xiàn)此現(xiàn)象。46.實驗結束后，使用過的培養(yǎng)基應該進行 處理后才能倒掉，這樣做的目的是保護環(huán)境（防止污染環(huán)境）。分值: 15分 查看題目解析 >12【生物-選修3：現(xiàn)代生物科技專題】已知pUC質粒上攜帶有IacZ+基因的一段序列，編碼β-半乳糖苷酶的α肽。而宿主細胞含有IacZ+的突變基因，其產物無β-半乳糖苷酶活性，但遇α肽，可發(fā)生α-互補作用，產生有活性的酶，使培養(yǎng)基中的無色物質X-Gal分解，菌落呈藍色；若將外源基因插入到質粒上IacZ+序列中，失去α-互補作用（注：宿主細胞菌落為白色）。圖甲為pUC質粒表達載體簡圖，小箭頭所指分別為限制性內切酶EcoRI、BamHI的酶切位點，tctR為四環(huán)素抗性基因，P為啟動子、T為終止子，ori為復制原點。圖乙表示目的基因的兩端分別有EcoRI、BamHI在內的多種酶的酶切位點。為獲得目的菌株，請分析回答下列問題：
47.為快速篩選目的基因，應將含有目的基因的DNA與pUC質粒表達載體分別用 酶切，酶切產物用 進行連接后將得到的混合物直接導入受體菌中，培養(yǎng)受體菌有的未被轉化（用A表示），有的被轉化，被轉化的菌株有三種（B含環(huán)化目的基因的菌株 C含質粒載體的菌株 D含插入了目的基因的重組質粒的菌株）。48.為篩選出插入了目的基因的菌株，需要將宿主細胞接種在含有 的培養(yǎng)基中。49.在培養(yǎng)基中，不能生長的菌株為 ；產生藍色菌落的菌株為 ；產生白色菌落的菌株為 （請用（1）中的A、B、C、D字母作答）。50.基因工程中除質粒作為基因載體外，還可用動植物病毒和 。12 第(1)小題正確答案及相關解析正確答案
EcoRⅠ DNA連接酶解析
用上述兩種限制酶同時切割目的基因后，目的基因的兩個黏性末端不同，這樣目的基因就不會自連城環(huán)狀，同樣用上述兩種限制酶同時切割質粒后，質粒的兩個黏性某端也不同，這樣質粒也不會自連，這樣當把切割后目的基因和切割后質?；旌虾螅挥心康幕蚝唾|粒才能相連。為快速篩選目的基因，應將含有目的基因的DNA與pUC質粒表達載體分別用EcoRⅠ酶切，酶切產物用DNA連接酶進行連接后將得到的混合物直接導入受體菌中?？疾榉较?/p>
意在考查考生能從材料中獲取基因工程原理的生物學信息，并能運用這些信息，結合所學知識解決相關的生物學問題的能力。解題思路
結合知識分析題干完成易錯點
內切酶12 第(2)小題正確答案及相關解析正確答案
（無色物質）X-Gal和四環(huán)素（3，寫不全0分）解析
由題意可知，“宿主細胞含有IacZ+的突變基因，其產物無β-半乳糖苷酶活性，但遇α肽，可發(fā)生α-互補作用，產生有活性的酶，使培養(yǎng)基中的無色物質X-Gal分解，菌落呈藍色”，因此為篩選出插入了目的基因的菌株，需要將宿主細胞接種在含有（無色物質）X-Gal和四環(huán)素的培養(yǎng)基中，觀察菌落是否是白色。考查方向
意在考查考生能從材料中獲取相關的生物學信息，并能運用這些信息，結合所學知識解決相關的生物學問題的能力。解題思路
結合知識分析題干完成易錯點
材料分析12 第(3)小題正確答案及相關解析正確答案
A、B C D解析
由于培養(yǎng)基中加入四環(huán)素，因此不含抗性基因的細菌不能生長，即在培養(yǎng)基中，不能生長的菌株為A、B；C含質粒載體的菌株由于沒有插入目的基因，因此產生藍色菌落；若將外源基因插入到質粒上IacZ+序列中，失去α-互補作用，D含插入了目的基因的重組質粒的菌株會導致產生白色菌落。考查方向
意在考查考生能從材料中獲取相關的生物學信息，并能運用這些信息，結合所學知識解決相關的生物學問題的能力。解題思路
結合知識分析題干完成易錯點
材料分析12 第(4)小題正確答案及相關解析正確答案
λ噬菌體衍生物解析
基因工程中除質粒作為基因載體外，還可用動植物病毒和λ噬菌體衍生物。考查方向
本題主要考查了基因工程的相關知識,意在考查考生能理解所學知識的要點，把握知識間的內在聯(lián)系，形成知識的網絡結構的能力。解題思路
A. 植物體雜交具有克服遠緣雜交不親和障礙的優(yōu)點
B. 雜交瘤細胞和骨髓瘤細胞可以在一個培養(yǎng)瓶中無限增殖
C. 植物細胞產物包括蛋白質、脂肪、藥物、香料、生物堿等
D. 試管動物培育過程涉及到動物細胞核移植和胚胎移植等技術
2. 培育“試管山羊”的基本過程如下圖所示，有關敘述正確的是（ ）
A. 可以取早期胚胎（如桑葚胚、囊胚）進行分割以增加胚胎的數量
B. 圖中剛采集的新鮮應當放在保溫瓶中（生理鹽水）存放
C. 乙表示受精作用，該過程在輸卵管中進行
D. 對供、受體母牛進行同情處理來維持其相同的生理環(huán)境，這為胚胎的收集提供可能
3. 以下對于胚胎工程的說法錯誤的是（ ）
A. 胚胎工程是指對動物早期胚胎或配子所進行的多種顯微操作和處理技術
B. 胚胎干細胞具有體積小，細胞核大和蛋白質合成旺盛等特點
C. 早期胚胎培養(yǎng)與動物細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液通常都需加入血清
D. 胚胎移植的主要意義是可充分發(fā)揮雌性受體的繁殖能力，縮短繁殖周期，增加一生繁殖的后代數量
4. 假設a、B為玉米的優(yōu)良基因，現(xiàn)有AABB、aabb兩個品種，控制兩對相對性狀的基因位于兩對同源染色體上，實驗小組用不同方法進行了實驗（見右圖），下列說法不正確的是（ ）
A. 過程①育種方法的原理是基因突變，最大優(yōu)點是能提高突變率，在短時間內獲得更多的優(yōu)良變異類型
B. 過程②③④育種方法的原理是基因重組，基因型aaB_的類型經④后，子代中aaBB所占比例是5/6
C. 過程⑤通常使用秋水仙素，它可抑制細胞分裂時紡錘體的形成
D. 過程⑥⑦應用了單倍體育種的方法，最大的優(yōu)點是明顯縮短育種年限
5. 下圖分別表示對幾種生物體內正在進行分裂的細胞進行觀察的結果，有關假設推論正確的是（ ）
c 染色單體][a組][b組][c組][染色體數][a b c][O][4N][2N][O][細胞相對數目] [細胞中的含量]
A. 若甲圖為有絲分裂過程中的某階段，則下一時期細胞中央將出現(xiàn)赤道板
B. 若圖乙表示有絲分裂過程中的某階段，則染色體著絲點分裂可發(fā)生在這一階段
C. 若圖乙表示減數分裂過程中的某階段，則同源染色體的分離可發(fā)生在這一階段
D. 若圖丙表示雄果蠅精巢內的幾種細胞，則C組細胞中可能出現(xiàn)聯(lián)會和四分體
6. 下列關于基因工程應用的敘述，正確的是（ ）
A. 運用基因工程技術，把有缺陷的基因切除，達到治療疾病的目的
B. 基因診斷的基本原理是DNA分子雜交
C. 一種基因探針能檢測水體中的各種病毒
D. 原核生物基因不能用來進行真核生物的遺傳改良
7. 下列說法正確的是（ ）
A. 質粒是廣泛存在于細菌細胞中的一種顆粒狀細胞器
B. 用適當的化學物質處理受體細菌表面，將重組DNA導入受體細菌
C. 質粒是基因工程中惟一用作運載目的基因的運載體
D. 利用運載體在宿主細胞內對目的基因進行大量復制的過程不能稱為“克隆”
8. 蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因之所以能在棉花的細胞中準確地表達出來，主要是因為（ ）
A. 目的基因能在植物細胞核中進行復制
B. 目的基因與棉花DNA的基本結構相同
C. 不同生物共用一套遺傳密碼
D. 不同生物具有相同的一套遺傳信息
9. 下圖為人工培養(yǎng)的肝細胞中DNA含量隨時間變化曲線，培養(yǎng)中所有細胞都處于細胞周期的同一階段。以下分析正確的是（ ）
A. 人工培養(yǎng)肝細胞的細胞周期是14小時
B. AB段主要變化是通過轉錄合成mRNA
C. 在BC段細胞內可能會發(fā)生基因重組
D. DE段有合成蛋白質的翻譯過程發(fā)生
10. 下列有關生物學實驗的敘述中，正確的是（ ）
A. 在觀察根尖分生組織細胞的有絲分裂實驗中，將解離、漂洗、染色的洋蔥根尖置于載玻片上，蓋上蓋玻片即可在顯微鏡下觀察
B. 在低溫誘導植物染色體數目的變化的實驗中，剪取誘導處理的根尖，立即放入解離液中解離，然后漂洗、染色、制片
C. 觀察線粒體，用新鮮的蘚類葉代替口腔上皮細胞，效果較佳
D. 選用紫色洋蔥鱗片葉表皮細胞觀察到質壁分離現(xiàn)象時，觀察不到染色體
11. 人類寄希望于利用干細胞（人體中具有分裂、分化能力的細胞）的分離和體外培養(yǎng)，在體外培育出組織器官，并最終通過組織或器官移植實現(xiàn)對臨床疾病的治療。能否用肌細胞代替干細胞（ ）
A. 不能，因為肌細胞與干細胞所含有的遺傳物質不同
B. 能，因為肌細胞雖然是分化的細胞，但在一定條件下也可脫分化，實現(xiàn)細胞全能性
C. 不能，因為肌細胞是高度分化的細胞，沒有分裂能力
D. 能，因為肌細胞與干細胞具有完全相同的遺傳物質
12. 關于桑椹胚和囊胚的比較，以下說法不正確的是（ ）
A. 囊胚期細胞分化是由于遺傳物質突變引起的
B. 囊胚期的細胞出現(xiàn)了細胞分化，但遺傳物質未發(fā)生改變
C. 桑椹胚的各細胞結構功能基本相同
D. 囊胚期內細胞團和滋養(yǎng)層細胞差異不是復制水平的差異，而是轉錄水平上的差異
13. 某種轉基因玉米能高效合成一種多肽類的蛋白質酶抑制劑，積累于莖中，讓取食它的害蟲的消化酶受抑制，無法消化食物而死。下列就該玉米對人類的安全性評論中，不符合生物學原理的是（ ）
A. 安全，玉米的蛋白酶抑制劑對人體的消化酶很可能無影響，因為人體消化酶和害蟲消化酶結構上存在差異
B. 安全，人類通常食用煮熟的玉米食品，玉米的蛋白酶抑制劑已被高溫破壞，不抑制人體消化酶
C. 不安全，玉米的食用部分也可能含有蛋白酶抑制劑，食用后使人無法消化蛋白質而患病
D. 不安全，玉米的蛋白酶抑制劑基因可通過食物鏈在人體細胞內表達，使人無法消化食物而患病
14. 目前，歐洲、亞洲許多國家都發(fā)現(xiàn)了禽流感疫情，并引起了人體感染，造成多人死亡?？茖W工作者經研究，發(fā)現(xiàn)了數種快速檢驗禽流感病原體的方法，以正確診斷禽流感，以下有關禽流感病原體研究、診斷的敘述錯誤的是（ ）
A. 鏡檢法：在光學顯微鏡下直接觀察病人的痰液或血液，以發(fā)現(xiàn)病原體
B. PCR：體外基因復制技術，可在幾十分鐘內把病原體的基因擴展到數百萬倍
C. 用特殊制備的病原體蛋白質與病人血清中的相關抗體特異性結合，以發(fā)現(xiàn)病原體
D. DNA探針技術：用放射性同位素、熒光分子等標記的DNA 分子做探針，利用DNA分子雜交原理來檢測病原體
15. 測定3類細菌對氧的需要，讓它們在3個不同的試管中生長，下圖顯示了細菌的生長層。據此判斷：只能在需氧培養(yǎng)基中繁殖、只能在無氧培養(yǎng)基中繁殖、在有氧和無氧的培養(yǎng)基中都能繁殖的細菌依次是（ ）
16. 聚合酶鏈式反應（PCR技術）是體外酶促合成特異DN段的一種方法，由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應組成一個周期，循環(huán)進行，使目的DNA得以迅速擴增，其簡要過程如右圖所示。下列關于PCR技術敘述不正確的是（ ）
A. PCR技術是在實驗室中以少量DNA制備大量DNA的技術
B. 反應中新合成的DNA又可作為下一輪反應的模板
C. PCR技術以核糖核苷酸為原料，以指數方式擴增
D. 應用PCR技術與探針雜交技術可以檢測基因突變
17. 花粉管通道法是指利用植物受精后花粉萌發(fā)形成的花粉管通道，將目的基因導入尚不具備細胞壁的合子，形成含有目的基因的胚。經培養(yǎng)、篩選，可獲得有特定性狀的轉基因植株。下列有關說法中不正確的是（ ）
A. 為了減少盲目性，可以通過人工合成的途徑來獲得目的基因
B. 目的基因導入受體細胞后，通過植物組織培養(yǎng)才能獲得相應的植株
C. 所得轉基因植株個體發(fā)育的起點是受精卵，形成該植株時無脫分化過程
D. 將目的基因導入葉綠體DNA中，可避免目的基因通過花粉傳遞而造成“基因污染”
18. “塑化劑”“口蹄疫”“瘋牛病”“艾滋病”是全世界關注的問題，下列說法錯誤的是（ ）
A. 口蹄疫疾病是由口蹄疫病毒感染有蹄類動物（如豬、牛等）的一種高傳染性疾病，人致病的機會很少
B. 2011年臺灣爆發(fā)的“塑化劑”食品污染事件，是一種病毒引起的污染
C. 艾滋病病毒能破壞人體的免疫系統(tǒng)，最終使人失去免疫能力而喪命
D. 瘋牛病是瘋牛病病毒感染牛引起的腦疾病，人類食用瘋牛病病牛制成的食品，會感染腦病變的致命疾病
19. 將無根的非洲菊幼苗轉入無植物激素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在適宜的溫度和光照等條件下培養(yǎng)一段時間后，應出現(xiàn)的現(xiàn)象是（ ）
20. “篩選”是生物工程中常用的技術手段，下列關于篩選的敘述中不正確的是（ ）
A. 重組質粒上的標記基因的作用是鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來
B. 單克隆抗體制備過程中，在完成細胞融合后，第一次篩選的目的是從不同種類的細胞中篩選出雜交瘤細胞
C. 單克隆抗體制備過程中，在完成細胞融合后，第二次篩選的目的是篩選出針對目標抗原的抗體為陽性的雜交瘤細胞
D. 基因工程中用不同種限制性核酸內切酶切割運載體和目的基因，酶切產物用DNA連接酶連接，將獲得的產物直接導入受體細胞
21. 如圖為洋蔥根尖有絲分裂的圖像（甲）和有絲分裂過程中DNA數量變化曲線圖（乙），其中A、B、C、D、E為細胞代號，請據圖回答：
（1）根據細胞周期寫出甲圖中所示細胞在有絲分裂中的順序 。
（2）甲圖中B細胞處于 期，其主要特點是染色體的 排列在細胞中央赤道板上。
（3）在乙圖中ab時間段內細胞發(fā)生的主要變化是 ，這個變化出現(xiàn)在甲圖的細胞 中（用圖中代號表示）。
（4）乙圖中bc時間段表示細胞分裂的 期。
（5）請在乙圖中相應的位置上畫出染色體數量變化曲線。
（1）癌細胞的兩個重要特點是 、 。
（2）過程②③合稱為 。
（3）圖中②過程中，主要需要 酶，其作用是 。
（4）根據圖中的信息，從信息交流的角度提出一種抑制癌細胞產生的方法 。
23. 下圖表示干細胞的三個發(fā)育途徑。據圖回答下列問題：
（1）由A細胞形成的B細胞仍然保持著其特有的 和 能力，A細胞到C細胞的過程是由 控制的。
（2）由A細胞到形成多個卵細胞的過程，則必須經過 和減數分裂。
（3）若D細胞是胰腺細胞，則結構⑦所起的作用是 。
關鍵詞：轉基因水稻;定性檢測;啟動子;終止子;Bt基因;多重PCR;Real-time PCR
中圖分類號：Q78;S511 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）02-0262-04
DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2015.02.002
Problems and Strategies Qualitatively Detecting Genetically-modified Rice with Multiplex PCR and Real-time PCR
QIU Juan
（Food Crops Research Institute，Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430064，China）
Abstract： As genetically-modified（GM） rice will be commercialized， qualitatively detecting GM rice becomes more and more important. Based authors’ practice in detecting of transgenic Bt rice with the quality standard of Chinese Ministry of Agriculture， the potential problems were analyzed from technical level and theoretical perspective. The detection of transgenic components （promoter， terminator， reference gene and target gene etc） of GM rice with PCR was discussed. The possible solutions were proposed from the principles of plant virology and genetic engineering based on previous reports.
Key words：genetically-modified（GM） rice;qualitative detection;promoter;terminator;Bt gene;multiplex PCR;real-time PCR
轉基因技術應用于作物以來，轉基因產品如玉米、大豆、棉花等都已有商業(yè)化的品種問世;目前在世界上使用最多的轉基因商業(yè)化基因是抗除草劑基因和Bt殺蟲基因。而水稻作為一種主糧，商業(yè)化步伐遠遠慢于這幾種作物;目前最有可能商業(yè)化的轉Bt殺蟲基因的是中國與國際水稻所合作研制的“華恢1號”、“Bt汕優(yōu)63”和歐洲研制的富含維生素A的Golden rice[1，2]。
自從國家給轉基因水稻發(fā)放了安全證書，轉基因水稻的商業(yè)化成為了熱門的議題。目前農業(yè)部發(fā)放安全證書的轉基因水稻有抗蟲轉基因水稻“華恢1號”和“Bt汕優(yōu)63”，國家制定了關于作物和轉基因水稻的檢測方法標準[1，3]。國家質量檢測部門有完善的種子和食品檢測系統(tǒng)，來定性檢測是否含有轉基因成分。但是隨著轉基因水稻即將大規(guī)模的種植，科研人員在研究和育種過程也有大量的樣品需要檢測，主要目的有以下幾個：①更好地進行常規(guī)品種轉基因育種工作，防止轉基因的品種污染常規(guī)品種，保持種質的純合，同時檢測轉基因的水稻在田間有沒有發(fā)生漂移;②節(jié)省人力物力，大量的水稻樣品送到專門的質檢部門檢測價格昂貴;③有些檢測樣品中的轉基因成分元件，是超出國家質量標準檢測范圍的。
轉基因作物和轉基因食品的檢測方法有很多，例如PCR、Southern Blot、基因芯片等[4-7]。常規(guī)和便捷的方法是普通PCR以及由其衍生出的半定量PCR方法[8，9];在國內外使用的最多定性作用更強的是Real-time PCR[10-12]。多重PCR檢測方法被廣泛使用[4]。本文根據自己的一些實踐，總結出了在食品檢驗、科研或者育種工作中進行多重PCR檢測分析轉基因樣品中的幾個要點。
1 污染源的杜絕
轉基因檢測中，只有杜絕一切污染源，才有可能在后續(xù)的檢測中做出正確的判斷。如果沒有做好防止污染，很容易出現(xiàn)假陰性和假陽性。因此所有的試劑須新鮮現(xiàn)配、滅菌，槍頭、離心管等要嚴格滅菌，玻璃器皿需要清洗干凈[13]。樣品必須防止交叉污染，條件允許的話，可以進口高質量的離心管、槍頭等，以便在后續(xù)的試驗中起到排除污染的作用[12]。
2 樣品DNA的提取方法
DNA的提取方法既可以采用經典的CTAB方法，也可以按照農業(yè)部的質檢標準書的方法，這兩種方法用于PCR和半定量PCR、Real-time熒光定量PCR都有很好的結果[3，14];條件允許的話，也可以采用試劑盒。有學者采用快速提取法獲得的轉基因番茄DNA，用于Real-time PCR檢測，取得了很好的結果;鑒于這一點，快速方法提取的轉基因水稻DNA，也應該可以適用于Real-time PCR的檢測，這就為檢測大量的水稻DNA樣品提供了便捷的途徑[3，15-17]。Cankar等[18]、Demeke等[19]在水稻轉基因檢測的實踐中，采取適用于RFLP分子標記檢測的水稻DNA快速提取法，取得了比較好的效果。
3 轉基因水稻的多重PCR檢測
根據農業(yè)部的質檢標準書，采用的是多重PCR和Real-time PCR的方法。在轉基因的檢測中，有4個檢測元件：啟動子、終止子、靶基因、內參基因。轉基因的定性檢測中，首先要檢測的是內參基因，因為內參基因能確定DNA模板的質量;然后是檢測啟動子和終止子，在檢測出啟動子或者終止子以后，還要進一步檢測靶基因。只有兩個以上的轉基因元件被檢測出，才能定性為轉基因的水稻[3，4，9，20]。
3.1 內參基因的檢測
在定性檢測轉基因水稻中，會設置內參基因，農業(yè)部的質檢標準書采用的是水稻sps（蔗糖磷酸合成酶）基因[3，21];也可以采用常規(guī)試驗中經常用的水稻β-Actin基因的引物（在不同的物種中高度保守，組織和細胞中的表達相對恒定內參基因的檢測），可以對模板進行定性為水稻的DNA，同時可以根據PCR產物條帶的亮度來確定模板的質量。
3.2 啟動子的檢測
3.2.1 CaMV 35S啟動子的檢測 根據農業(yè)部制定的質檢標準書，在目前的轉基因水稻中的定性檢測一般檢查的是花椰菜病毒35S啟動子。早期的水稻轉基因多采用這個啟動子，這次農業(yè)部批準的“Bt汕優(yōu)63”也是采用的CaMV 35S啟動子。
3.2.2 含CaMV 35S啟動子的轉基因水稻和病毒感染的定性區(qū)分 轉基因食品中CaMV 35S啟動子中有一個關鍵性問題就是區(qū)別轉基因與病毒感染和污染[22-24]。在食品的安檢和十字花科蔬菜的轉基因定性檢測中，通常會檢測是否有CaMV 35S啟動子轉基因元件還是被花椰菜病毒感染了[22]。但是在確定沒有污染的情況下，檢測出35S啟動子并不能定性樣品含有轉基因成分。花椰菜病毒會感染很多十字花科的蔬菜，病毒基因組也會整合到其侵染的植物基因組里面（感染水稻的可能性很小），在這種情況下，可以根據花椰菜病毒的外殼蛋白基因或復制酶基因設計特異性引物，也可以根據被花椰菜病毒感染后的特殊產物設計特異性引物，在轉錄水平上來定性是含CaMV 35S啟動子成分的樣品還是被花椰菜病毒感染了[25-31]。在一般情況下，水稻并不是花椰菜病毒的宿主，被感染的可能性不大，因此，這項檢測只有在質量檢測要求特別嚴格的情況下會被采用。同時，通過定量熒光Real-time PCR也可以排除樣品是被花椰菜病毒感染或者污染還是轉基因，具體的方法參見后文關于熒光PCR定量檢測的內容[3，10]。
3.2.3 其他啟動子 隨著轉基因技術的不斷發(fā)展，更多被農業(yè)科學家采用的是組織特異性的啟動子，例如新一代的轉基因水稻就是采用組織特異性表達的啟動子[32]。因此，隨著轉基因水稻品種越來越多，更多種類的啟動子檢測將會出現(xiàn)在質檢標準中[33]。
3.3 終止子的檢測
3.3.1 植物基因工程的原理 根癌農桿菌的Ti質粒和發(fā)根農桿菌的Ri質粒，其特定部位能與植物的DNA發(fā)生整合，因此常被用作植物基因工程中的載體。
3.3.2 Nos終止子 在轉基因植物中，常采用Nos終止子來構建載體，“華恢1號”和“Bt汕優(yōu)63”也是采用的Nos終止子， 因此可以按照農業(yè)部的質檢標準書用PCR定性檢測Nos終止子[3，34]。Nos終止子是農桿菌菌株Ti質粒的T-DNA上的胭脂堿合成酶的終止子。胭脂堿屬于冠癭堿，在與植物共生或者轉化植物以后，會釋放出對植物有害的毒素，因此在Ti質粒上構建載體的過程中，會剪切掉這個基因，但是會保留這個基因的終止子（Nos），并通常用這個Nos終止子作為轉基因的終止子[35]。
3.3.3 其他終止子 植物轉基因的構建方法表明，轉基因載體基本采用的是農桿菌T-DNA上的冠癭堿的終止子。農桿菌的不同菌株含有不同Ti質粒，其包含的T-DNA上的冠癭堿也不同。例如，農桿菌菌株LBA4404的毒性區(qū)來自章魚堿型質粒，農桿菌菌株GV3101的毒性區(qū)來自胭脂堿型質粒，農桿菌菌株EA101、EA105的毒性區(qū)來自琥珀堿型質粒。冠癭堿有4種類型：章魚堿（Octopine）、胭脂堿（Nopaline）、農桿堿（Agropine）、琥珀堿（Succinamopine），其終止子分別為 Ocs、Nos、Ags、Sus。在基因工程上最常用的是上面提到的胭脂堿型質粒和它的Nos終止子，其次就是章魚堿型質粒和它的Ocs終止子[36-38]。因此在轉基因的定性檢測中，可以根據每個實驗室采用的質粒和構建方法的不同，設計別的終止子引物，例如Ocs終止子的引物[35]。
3.4 靶基因的檢測
最近中國頒發(fā)安全證書的“Bt汕優(yōu)63”和“華恢1號”都是轉基因抗蟲水稻，是高抗鱗翅目害蟲轉基因水稻品系;含有Bt融合型殺蟲蛋白基因Cry1Ac/Cry1Ab[1]。對這兩種轉基因水稻的檢測，需要根據Bt融合殺蟲蛋白的基因來設計引物。
隨著越來越多的轉基因水稻將要獲批準上市，農業(yè)科研單位在種質創(chuàng)新和科研中的需要，會有更多的農用基因在檢測中出現(xiàn)[33]。
3.5 標記基因的檢測
在轉基因水稻中常會含有GUS基因、抗生素基因、除草劑等標記基因，因此也可以對這些轉基因元件進行檢測;但是隨著轉基因技術的發(fā)展，在現(xiàn)階段轉基因育種中，標記基因在后期的工作中通常用共轉化等方法被剔除掉，這樣剔除了標記基因的品種才更安全，才會用于商業(yè)化[39，40]。因此，標記基因的檢測在早期的轉基因篩選檢測中會用到，但是在后期的育種鑒定一般不會采用。不過也可以用在轉基因的后期工作中，鑒定品種是否進一步剔除了標記基因。
4 模板和引物
根據農業(yè)部的質檢標準書，采用的是含有“Bt汕優(yōu)63”或“華恢1號”的DNA作為陽性模板，并采用CaMV 35S啟動子、Nos終止子、Bt融合蛋白基因和內參基因來檢測樣品;陽性模板應該為單拷貝插入，這樣將便于在定量熒光PCR的分析。
由于樣品的不確定性，在進行上述檢測以外，還可以采用別的模板和引物來檢測可能出現(xiàn)的其他種類的轉基因元件。例如Ocs終止子、抗除草劑基因、花椰菜病毒的基因、韌皮部特異性表達啟動子等。如果沒有現(xiàn)成的水稻DNA模板，含有這些元件基因的質粒也可以被選作模板，在做PCR的過程中，要根據試劑盒中的說明，水稻模板DNA和質粒DNA要選擇不同的終濃度[41，42]。引物要送到技術質量好的公司合成，模板要保證質量和選擇的正確性，防止反應出現(xiàn)假陰性、假陽性。
5 轉基因產品的定量Real-time PCR的定性分析作用
轉基因中的定量實時熒光PCR是為普通PCR做補充的。由于轉基因的普通PCR檢測靈敏度達到0.1%[20]， 而且花椰菜病毒的35S啟動子非常容易污染檢測樣品，在沒有別的辦法排除樣品被污染或病毒感染的情況下，實時熒光PCR可以提供非常好的分析數據[3，10，12]。以被含CaMV 35S啟動子的外源物污染和被病毒感染的樣品為例，分析如下：第一，樣品被含有CaMV 35S啟動子的外源物污染。這種情況下熒光PCR會檢測出35S啟動子，但是其豐度會比單拷貝轉基因DNA陽性模板的豐度要低;第二，樣品被病毒感染。由于病毒一般不會感染植物的每個細胞，因此檢測出來的啟動子豐度也會比單拷貝轉基因的DNA陽性模板要低。因此可以根據定量PCR來區(qū)分樣品是轉基因還是被污染或者被病毒感染了[9，10]。
6 小結
針對這次農業(yè)部發(fā)放安全證書的兩個轉基因水稻品種“Bt汕優(yōu)63”和“華恢1號”的PCR定性檢測，可以選取含有啟動子CaMV 35S、終止子Nos、含有Bt融合蛋白基因的轉基因水稻DNA作為陽性模板，選取非轉基因水稻DNA作為陰性模板，對水稻DNA樣品進行檢測。但這種檢測只能定性檢測出樣品是不是“Bt汕優(yōu)63”或“華恢1號”，國內外的實驗室在轉基因生產育種中，還生產了很多其他的轉基因水稻品種，采用的轉基因元件跟這兩個是不完全一樣的，甚至完全不一樣。對一個未知樣品完全定性確定是否為轉基因的水稻，還需要多設計出幾對引物（其他終止子、啟動子、靶基因）進行檢測。由于越來越多的轉基因品種并非采用的CaMV 35S的啟動子，而且這個啟動子在檢測中很容易受到污染和病毒感染的干擾，因此檢測終止子反而更為可靠?，F(xiàn)有的報道結果表明，在構建植物基因工程載體中，基本上采用的是農桿菌的T-DNA上的冠癭堿的終止子（Nos終止子、Ocs終止子），因此，可以根據這些終止子設計引物組，對未知樣品進行檢測。此外，本研究也可以在實踐中摸索出快速提取水稻DNA的方法，提取的DNA質量可以適用于Real-time PCR和半定量常規(guī)PCR，可以為大量的轉基因水稻樣品檢驗提供便捷。
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