導(dǎo)語：在基因治療的基本策略的撰寫旅程中，學(xué)習(xí)并吸收他人佳作的精髓是一條寶貴的路徑，好期刊匯集了九篇優(yōu)秀范文，愿這些內(nèi)容能夠啟發(fā)您的創(chuàng)作靈感，引領(lǐng)您探索更多的創(chuàng)作可能。

第1篇

【關(guān)鍵詞】 CDTK基因;視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤;自殺基因治療;5FC;GCV

Abstract

AIM: To investigate the killing effects of tumor cells specific vector of suicide gene of CDglyTK driven by hTERT promoter on retinoblastoma Y79 cells in vitro.

METHODS:At first，the recombinant plasmid was transfered into Y79 cells with electroblot as a delivery system. RTPCR and Western blot analysis were used to determine the CDTK mRNA and protein expression in Y79 cells which had been transfected by pcDNA3.1CMV hTERT CDTK plasmid vector. The conversion efficiency of 5FC into 5FU in CDglyTKexpressing Y79 cells was measured by HPLC. The killing effects of double suicide genes on Y79 cells that treated with 5FC，GCV of different concentrations were determined by the method of MTT.

RESULTS:The expression of CDTK gene in Y79 cells was certificated by RTPCR and Western blot and a 59kD protein was obtaind which was equal to the sequence expection of CDTK gene. In MTT analysis，there was significant difference between transfected and nontransfected survival Y79 cells(P

CONCLUSION:The recombinant plasmid vector pcDNA3.1CMV hTERT CDTK can be transcribed and translated into CDTK fusion protein in Y79 cells.The transfer of the CDglyTK fusion gene into Y79 cells followed by the administration of 5FC or GCV can kill Y79 cells in vitro. The killing effect of two predrugs is stronger than that of one predrug.

KEYWORDS: CDglyTK gene; retinoblastoma;suicide gene therapy;5FC; GCV

自殺基因治療是近年來腫瘤研究的熱點領(lǐng)域之一，也是目前最有可能有效應(yīng)用于臨床的腫瘤基因治療策略之一。構(gòu)建安全高效的載體是基因治療的關(guān)鍵。我們已經(jīng)成功的構(gòu)建了含有hTERT啟動子的腫瘤特異性殺傷載體pcChCDTK[1]。我們將探討該載體對人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79細(xì)胞在體外的作用。

1材料和方法

1.1材料

Y79細(xì)胞株[美國模式菌種收集中心(ATCC)];RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基(Gibco);胎牛血清(Gibco);5FC，5FU，GCV(Sigma);Reverse Transcription system kit(Invitrogen);Trizol(Gibco); QIAfilterTM plasmid Maxi kit(Qiagen); Triton X100(CalBiochem); ECL試劑盒(Amersham pharmacia biotech); PVDF膜(Amersham pharmacia biotech);雙丙烯酰胺(BioRad); MTT(Sigma);鼠TK mAb(QED公司);兔抗鼠IgG二抗(KPL公司);蛋白質(zhì)Marker(上海生化試劑公司);實驗所用引物 (上海生工生物工程有限公司)：yCDrt：5’ACGCTGTGTTGTCGGTGAGAA3’;TKrt：5’CAC CACCACGCAACTGCTG3’;βactin F：5’CACCCTGAAGTA CCCCATCG3’;βactin R：5’TTGCCAATGGTGATGACCTG3’。

1.2方法

將經(jīng)過證實的含有pcChCDTK質(zhì)粒的JM109菌液0.2mL接種到200mL含50mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃，280r/min的搖床上培養(yǎng)16h，將菌液轉(zhuǎn)移到離心瓶中。然后按照QIAfilterTMplasmid Maxi kit提供的步驟進(jìn)行操作提取質(zhì)粒pcChCDTK，干燥后，加無菌水溶解質(zhì)粒300μL，用Duc 640分光光度計測定DNA含量，20℃分裝保存。用RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)Y79細(xì)胞，每日在倒置相差顯微鏡下觀察。Y79細(xì)胞懸浮生長，培養(yǎng)中細(xì)胞可聚集成團(tuán)并沉集于培養(yǎng)瓶底部，當(dāng)細(xì)胞基本鋪滿瓶底即可傳代，按照1∶2～1∶4傳代。將傳代后的Y79細(xì)胞培養(yǎng)24h后，細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期，即可用于電轉(zhuǎn)化。未轉(zhuǎn)染Y79細(xì)胞生長迅速，傳代后培養(yǎng)24h后，細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期。取上述進(jìn)入對數(shù)生長期并基本鋪滿瓶底的細(xì)胞，在22℃，1000r/min的條件下，離心10min，收集細(xì)胞。用0.01mol/L PBS 10mL重懸細(xì)胞，取細(xì)胞懸液20μL，用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，其余細(xì)胞在22℃，1000r/min條件下，離心10min，重新收集細(xì)胞;根據(jù)計數(shù)結(jié)果，用0.01mol/L PBS以6.25×109/L的密度重懸細(xì)胞。取800μL細(xì)胞重懸液加入到含有pcChCDTK質(zhì)粒20μg的EP中，吹打混勻，然后轉(zhuǎn)入0.4cm的電擊杯中，以2kV，25μF的條件進(jìn)行電擊。電擊后，迅速將電擊產(chǎn)物分至已加入10mL 200mL/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液的75cm2培養(yǎng)瓶中，置37℃，50mL/L CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。電轉(zhuǎn)染后的Y79細(xì)胞生長與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相似。倒置相差顯微鏡下見細(xì)胞懸浮生長，形狀飽滿，色澤鮮亮，聚集成團(tuán)。

1.2.1 CDTK基因表達(dá)的檢測

提取Y79細(xì)胞RNA;參照reverse transcription system kit進(jìn)行RTPCR反應(yīng);取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μL作為模板，以yCDrt和TKrt為引物擴(kuò)增CDTK，同時用βactin擴(kuò)增引物作對照，RTPCR產(chǎn)物用8g/L瓊脂糖凝膠跑膠檢測。另取未轉(zhuǎn)染的Y79細(xì)胞設(shè)為對照，同法處理。取轉(zhuǎn)染48h和未轉(zhuǎn)染的Y79細(xì)胞預(yù)處理;固定玻片;配制分離膠和堆積膠;上樣;跑膠;轉(zhuǎn)膜;封閉;加一抗;洗一抗;加二抗;洗二抗;顯色;曝光。

1.2.2 5FU濃度的檢測

人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞株Y79用含200mL/L胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液在37℃，50mL/L CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)。細(xì)胞在轉(zhuǎn)染腫瘤特異性殺傷載體pcChCDTK前24h換液，調(diào)整細(xì)胞密度使之在轉(zhuǎn)染時達(dá)基本鋪滿瓶底。將細(xì)胞在22℃，1000r/min的條件下，離心10min，收集細(xì)胞，用適當(dāng)體積的無血清的RPMl1640培養(yǎng)液重懸，細(xì)胞計數(shù)，使之密度為6.25×109/L。取細(xì)胞懸液800μL加入自殺基因載體pcChCDTK 20μg，將其混勻，轉(zhuǎn)入0.4cm的電擊杯中，以2kV，25μF的條件進(jìn)行電擊。電擊后，細(xì)胞接種入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，24h后收集細(xì)胞并用1×PBS洗3次，然后用含200mL/L胎牛血清的RPMl1604培養(yǎng)液配成細(xì)胞懸液，以每孔2×105個細(xì)胞的濃度植入24孔板，每孔培養(yǎng)液體積1mL。24h后加入前體藥物5FC(200mg/L)。在加5FC 24h后取其細(xì)胞上清，用高效液相色譜儀(HPLC)檢測其5FU的濃度。配5FC及5FU標(biāo)準(zhǔn)品的濃度梯度做標(biāo)準(zhǔn)曲線。LC10A高效液相色譜儀;分析柱: Shimpack CLCODS(5μm，150mm×4.6mm，ID);預(yù)柱YWGODS(10μm，10mm×4.6mm，ID);流動相：甲醇/水(20/80);流速1mL/min;檢測波長266nm;柱溫37℃。10μL進(jìn)樣。

1.2.3前體藥物對細(xì)胞毒性的檢測

采用Western Blot技術(shù)檢測新融合自殺基因CDTK在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79細(xì)胞中的蛋白質(zhì)水平表達(dá)。人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞株Y79用含200mL/L胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液在37℃，50mL/L CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)。以2×105個細(xì)胞的密度將細(xì)胞接種到96孔板中培養(yǎng)，每孔體積200μL。24h后，加入不同濃度的前體藥物100μL，即5FC以0，25，50，100，200，400，800mg/L;GCV以0，2，4，8，16，32，64mg/L加入96孔板。每個濃度梯度有4孔。留1孔不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)液做空白對照孔。在37℃，50mL/L CO2的條件下，細(xì)胞不換液培養(yǎng)5d后，每孔加入(5g/L) MTT溶液20μL，37℃，繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，吸去培養(yǎng)上清液。每孔加入DMSO 150μL，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。比色：選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上調(diào)定各孔吸收值。以每天進(jìn)行換液的細(xì)胞做對照，假設(shè)細(xì)胞存活率為100%，將其它各細(xì)胞孔的吸收值與其比較得出各處理組細(xì)胞的平均存活率。另視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前24h換液，調(diào)整細(xì)胞密度使之在轉(zhuǎn)染時達(dá)基本鋪滿培養(yǎng)瓶底。將pcChCDTK載體電轉(zhuǎn)染Y79細(xì)胞。電擊后，細(xì)胞接種入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，24h后，收集細(xì)胞并用0.01mol/L PBS洗3次，然后用含200mL/L胎牛血清的RPMl1604培養(yǎng)液配成細(xì)胞懸液，以每孔2×105個的密度植入96孔板中培養(yǎng)，每孔體積200μL。24h后加入不同濃度的前體藥物100μL，5FC+GCV以兩藥的對應(yīng)濃度加入96孔板，每個濃度梯度有4孔。留一孔不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)液做空白對照孔。然后用MTT法檢測細(xì)胞存活率。統(tǒng)計學(xué)分析：所得數(shù)據(jù)用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計，采用StudentNeuman Keuls(SNK)檢驗，以P

2結(jié)果

2.1 Y79細(xì)胞轉(zhuǎn)染后CDTK基因的表達(dá)

RTPCR檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組可見一403bp特異條帶，與預(yù)期大小一致(圖1)。而在未轉(zhuǎn)染的對照組細(xì)胞中，未擴(kuò)增出403bp特異條帶。在兩組中均擴(kuò)增出作為內(nèi)對照的βactin產(chǎn)物561bp條帶。分析結(jié)果顯示：大小為42kD的內(nèi)參βactin蛋白條帶在轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的Y79細(xì)胞中均可見，一個大小為59kD的條帶，在轉(zhuǎn)染了pcChCDTK載體的Y79細(xì)胞中可見，這與yCDTK基因序列分析的預(yù)期蛋白大小一致，為自殺基因yCDTK蛋白。未轉(zhuǎn)染pcChCDTK的Y79細(xì)胞中則沒有59kD的條帶出現(xiàn)(圖2)。

2.2 Y79細(xì)胞轉(zhuǎn)染后5

FC轉(zhuǎn)化效率 加5FC 24h后上清中5FU的濃度平均含量為169mg/L，5FC向5FU的轉(zhuǎn)化效率約為84.5%。

2.3前體藥物對Y79細(xì)胞的毒性

將生長良好的人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79細(xì)胞，按每孔2×105個細(xì)胞接種到96孔板中培養(yǎng)。加入不同濃度的前體藥物5FC培養(yǎng)5d，平均細(xì)胞存活率分別為98.2%，94.7%，90.5%，88.2%，89.4%，86.4%和83.9%。SNK檢驗表明，各梯度間的細(xì)胞存活率存在顯著性差異(P

2.4前體藥物對用腫瘤殺傷載體轉(zhuǎn)染的人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞的毒性檢測

將電轉(zhuǎn)了pcChCDTK的人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞，按相同的密度將細(xì)胞接種到96孔板中培養(yǎng)。加入不同濃度的前體藥物5FC培養(yǎng)5d，平均細(xì)胞存活率分別為94.0%，91.6%，85.1%，80.0%，72.7%，69.9%和62.7%。SNK檢驗表明，各梯度間的細(xì)胞存活率存在顯著性差異(P

3討論

目前，相對于傳統(tǒng)的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma，RB)治療方法而言，RB基因治療不僅可以彌補(bǔ)光凝固治療、光動力學(xué)治療、溫?zé)嶂委煛⒗鋬鲋委煹膽?yīng)用局限性，而且不會產(chǎn)生諸如化學(xué)治療、放射治療的副作用，更不會因為眼球摘除所導(dǎo)致的致殘性而造成患兒心理障礙影響生圖1RTPCR產(chǎn)物凝膠電泳圖 M:DL2000 Marker;1:轉(zhuǎn)染組可見預(yù)期的CDTK(403bp)目的片段和βactin(561bp);2:未轉(zhuǎn)染組;3:陰性對照。圖2Western Blot檢測CDTK的表達(dá) A：1，2:βactin(42kD);B：1:轉(zhuǎn)染pcChCDTK的Y79細(xì)胞，出現(xiàn)一條約59kD蛋白;2:未轉(zhuǎn)染的Y79細(xì)胞。

存質(zhì)量。因此，RB基因治療的研究越來越為人們所重視，并且通過不同的治療策略取得了一系列的研究進(jìn)展?，F(xiàn)階段對RB基因治療的研究主要集中在4種不同的基因上，包括自殺基因、抑癌基因、抗血管生成基因以及促凋亡基因。RB發(fā)生的分子機(jī)制還不是太清楚，而且與RB形成相關(guān)的抑癌基因凋亡誘導(dǎo)基因種類繁多，與腫瘤血管形成相關(guān)的誘導(dǎo)因子和抑制因子多種多樣，且分子機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。我們選擇雙自殺基因CDTK作為目的基因，實施RB的自殺基因治療。首先，自殺基因作為腫瘤基因治療的候選基因，已經(jīng)在多種腫瘤開展研究[27]。其表達(dá)產(chǎn)物和前體藥物相互作用來實現(xiàn)腫瘤基因治療的機(jī)制比較清楚。其次，自殺基因和前體藥物相互作用產(chǎn)生的毒性物質(zhì)能通過不同方式實現(xiàn)對鄰近腫瘤細(xì)胞的旁殺效應(yīng)，包括直接分泌到細(xì)胞外旁殺，或通過細(xì)胞間隙連接旁殺，或通過產(chǎn)生凋亡小體、免疫介導(dǎo)來實現(xiàn)旁殺。同時，目前的研究表明，自殺基因系統(tǒng)治療RB是安全有效的[8]。我們設(shè)計的含有雙自殺基因CDTK的載體通過電轉(zhuǎn)染的方式導(dǎo)入了視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞株Y79細(xì)胞。48h后，提取轉(zhuǎn)染Y79細(xì)胞RNA，RTPCR的結(jié)果可見一403bp特異條帶，與預(yù)期大小一致，顯示雙自殺基因CDTK在細(xì)胞中mRNA水平得到了表達(dá)。Western blot的結(jié)果也同樣顯示，載體轉(zhuǎn)染的Y79細(xì)胞中，59kD的目的基因蛋白有明顯的表達(dá)。這兩個實驗結(jié)果充分說明，我們構(gòu)建的雙自殺基因CDTK在靶細(xì)胞Y79中得到表達(dá)。先前的研究顯示，被設(shè)計得的融合基因yCD/UPRT、大腸桿菌CDglyTK以及yCDglyTK具有最強(qiáng)的催化前體藥物向細(xì)胞毒物轉(zhuǎn)化的能力。我們通過HPLC檢測5FU的濃度，上清中5FU的濃度平均含量為169mg/L，故5FC向5FU的轉(zhuǎn)化效率約為84.5%，說明我們所構(gòu)建的腫瘤特異性雙自殺基因載體具有很強(qiáng)的催化前體藥物向細(xì)胞毒性物質(zhì)轉(zhuǎn)化的能力。

雙自殺基因療法是將兩種自殺基因整合在一起，通過載體轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，其在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的融合基因產(chǎn)物具備兩種酶的活性。因此，雙自殺基因療法可以大大提高抑制腫瘤生長的功效，同時使得前體藥物的用量減半。大量資料表明雙前體藥物對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用要強(qiáng)于單前體藥物。但也有資料顯示雙自殺基因之間可能存在拮抗效應(yīng)。在體外實驗中，單獨加5FC的細(xì)胞殺傷最強(qiáng)，要高于5FC和GCV都加的組，而單獨加GCV的細(xì)胞殺傷力最低， CD和TK之間沒有協(xié)同作用，反而可能會相互干擾各自功能的運(yùn)行。原因可能有兩個方面：(1)可能是融合基因yCDglyTK在同時加5FC和GCV時，CD/5FC和TK/GCV兩種系統(tǒng)的功能出現(xiàn)拮抗效應(yīng);(2)可能是在yCDglyTK融合基因中，由于某種原因，CD和TK的活性在這個融合基因中得到提高，使CD/5FC和TK/GCV兩種系統(tǒng)的抑瘤能力同時或其中一種得到增強(qiáng)。當(dāng)E.coli CD和HSV1 TK基因同時在一種細(xì)胞中表達(dá)時，會存在相互干擾作用。這種干擾作用的機(jī)制到目前還沒搞清楚，但干擾作用可能不是發(fā)生在基因的轉(zhuǎn)錄期，而是在轉(zhuǎn)錄之后，TK介導(dǎo)的5FUMP的磷酸化會產(chǎn)生無毒的5FdUDP和5FdUTP，而不是毒性產(chǎn)物5FUDP和5FUTP，從而減低了CD/5FC的細(xì)胞毒性作用;或者CD介導(dǎo)的對GCV，ACV等的脫胺反應(yīng)減低了TK/GCV系統(tǒng)的細(xì)胞毒性。yCD/UPRT基因中UPRT的酶活性與單獨的UPRT酶活性大致相等，但是yCD/UPRT基因中的CD酶活性要高于單獨CD酶活性100倍。這種酶活性的改變可能與這3種酶的蛋白質(zhì)特性不同有關(guān)。加入不同濃度的前體藥物5FC，GCV或5FC+GCV于電轉(zhuǎn)了pcChCDTK的人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79細(xì)胞培養(yǎng)5d， SNK檢驗表明，與未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞對應(yīng)濃度組比較，當(dāng)5FC濃度達(dá)到100mg/L后各對應(yīng)濃度平均細(xì)胞存活率組間均存在差異(PGCV >5FC。在本實驗中，單前體藥物對雙自殺基因CDTK載體轉(zhuǎn)染的Y79細(xì)胞均有殺傷作用，但雙前體藥物的殺傷作用要強(qiáng)于單前體藥物。分析產(chǎn)生這種結(jié)果的原因，我們認(rèn)為：(1)雙自殺基因載體具有很強(qiáng)的催化前體藥物向細(xì)胞毒物轉(zhuǎn)化的能力;(2)這可能與我們加入的CMV增強(qiáng)子能大大促進(jìn)hTERT啟動子啟動下游目的基因的表達(dá)有關(guān)，因為CMV增強(qiáng)子具有強(qiáng)大的增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄能力，且沒有組織特異性。

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第2篇

關(guān)鍵詞：非小細(xì)胞肺癌；中醫(yī)；西醫(yī)；治療進(jìn)展；展望

中圖分類號：R273文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1007-2349（2011）11-0085-03

非小細(xì)胞型肺癌（nonsmallcelllungcancer，簡稱NSCLC），是發(fā)生于肺部的常見癌癥。根據(jù)病理學(xué)組織結(jié)構(gòu)，可分為鱗癌、腺癌、大細(xì)胞癌等不同類型，約占肺癌總數(shù)的80~85%[1]。目前治療以西醫(yī)治療為主，其中以手術(shù)治療、放療、化療為主要治療手段。中醫(yī)作為輔助療法不但可減輕放、化療所致的毒副作用，而且有利于放、化療順利進(jìn)行，在延長生存期等方面取得了較為滿意的療效。從總體治療效果看，NSCLC的臨床治療已取得很大進(jìn)展。本文就NSCLC的臨床中西醫(yī)治療進(jìn)展與展望作一綜述。

1外科治療

11一般手術(shù)治療一般手術(shù)治療仍然是目前治療早期非小細(xì)胞肺癌最理想的方法。手術(shù)方法有肺葉切除、一側(cè)全肺切除、袖式肺葉切除、氣管隆凸再造、氣管-肺動脈成形術(shù)等手術(shù)方法。同時需高度重視淋巴結(jié)清掃，只有通過系統(tǒng)肺門和縱隔淋巴結(jié)清掃才能達(dá)到完全切除和標(biāo)準(zhǔn)分期的目的。

12微創(chuàng)胸外科手術(shù)治療目前，肺癌微創(chuàng)外科技術(shù)主要有3種手術(shù)方式，即視頻輔助胸腔鏡手術(shù)（video-assistedthoracoscopicsurgery，VATS）、機(jī)器人輔助胸腔鏡手術(shù)（robot-assistedthoracoscopicsurgery，RATS）和保護(hù)胸壁肌肉的小切口開胸手術(shù)（muscle-sparingminithoracotomy，MSMT）。（1）VATS：目前中國多家胸外科中心已開展VATS肺癌切除術(shù)，在2008年第8次全國胸心血管外科學(xué)術(shù)會議上，華西醫(yī)院劉倫旭介紹了更具有操作性、更加規(guī)范的“單向式胸腔鏡肺葉切除術(shù)”，標(biāo)志著中國VATS肺癌切除術(shù)的成熟。（2）RATS：近年，機(jī)器人已被引入外科手術(shù)中，這揭示了未來胸外科的發(fā)展趨勢和方向[2]。2006年美國紐約紀(jì)念醫(yī)院[3]報告了34例RATS肺葉切除的臨床資料，無手術(shù)死亡，4例（12%）中轉(zhuǎn)開胸，平均清除4組淋巴結(jié)，中位手術(shù)時間218min，中位胸腔引流時間3d，中位住院時間45d。（3）MSMT：隨著器械外科技術(shù)的進(jìn)步和小切口下手術(shù)操作技巧的提高，經(jīng)MSMT可方便地施行與傳統(tǒng)開胸手術(shù)相同的解剖性肺切除和系統(tǒng)淋巴結(jié)清掃，已能對絕大多數(shù)具備手術(shù)適應(yīng)證的肺癌實施根治性切除，獲得與傳統(tǒng)后外側(cè)切口肺癌切除術(shù)相同的治療結(jié)果。

2化療

目前化療方案大致可分為兩類：以鉑類藥物為基礎(chǔ)的雙藥聯(lián)合方案和不含鉑類藥物的方案。（1）以鉑類藥物為基礎(chǔ)的雙藥聯(lián)合方案是目前治療NSCLC較常用的一種手段，藥物的組合方式也有多種，鉑類聯(lián)合新藥是目前治療的首選方案[4]。對于有良好預(yù)后因素的晚期NSCLC患者采用聯(lián)合順鉑與健澤、紫杉醇、異長春花堿化療取得了令人滿意的有效率；對于沒有良好預(yù)后因素或老年患者，采用異長春花堿、健澤或紫杉醇單藥治療更為合適[5]。（2）不含鉑類藥物的方案藥物主要是紫杉醇、多西他賽、泰素帝、吉西他濱等。目前最引人注目的方法是“TXT”（泰索帝）75mg/m2（毫克每平方米體表面積）單一藥物治療[6]。

3放療

根據(jù)目前的研究，放療可分為術(shù)前放療、術(shù)中放療和術(shù)后放療3種方法。術(shù)前放療的目的為清除手術(shù)區(qū)域以外的亞臨床病變，減小腫瘤體積以及相鄰組織之間的浸潤，減少局部種植和轉(zhuǎn)移的機(jī)會，以提高切除率和生存率。但是臨床實踐顯示上述目的未能達(dá)到，并沒有使患者受益，臨床上已不常規(guī)采用[7]。術(shù)中放療的目的是降低局部復(fù)發(fā)率，是近年發(fā)展的在手術(shù)殘留部位以電子線進(jìn)行的一次性大劑量（15gy～25gy）照射，手術(shù)傷口愈合后再行體外高能放療。術(shù)后放射治療可提高生存率，對于手術(shù)中癌腫組織未能全部切除或支氣管斷端殘留癌浸潤的病例可放置金屬標(biāo)記行放療。

4分子靶向治療

分子靶向治療比傳統(tǒng)的化療具有更高的選擇性，毒副作用小，是今后腫瘤治療的新趨勢[8]。目前臨床應(yīng)用的分子靶向治療藥物主要有以下3類：（1）作用于表皮生長因子受體（EGFR）酪氨酸激酶抑制劑是一種跨膜蛋白，為原癌基因EerB1（Her21）的表達(dá)物。這類藥物包括易瑞沙和埃羅替尼等多種藥物。（2）作用于血管生成的靶向藥物是一種重組人源化抗血管內(nèi)皮生長因子單克隆抗體，由培養(yǎng)在含慶大霉素培養(yǎng)基中的中國倉鼠卵巢哺乳細(xì)胞表達(dá)體系生產(chǎn)。這類藥物主要有貝伐單抗等。（3）多靶點治療藥物是一種口服多靶點治療藥物，能選擇性地抑制血管內(nèi)皮生長因子依賴的腫瘤血管形成，而且對表皮生長因子受體也有一定抑制作用。這類藥物有ZD6474等。

5免疫治療

51主動免疫療法主要有非特異性主動免疫療法和特異性主動免疫療法。（1）非特異性主動免疫療法：目前主要應(yīng)用具有免疫調(diào)節(jié)作用的刺激因子通過非特異性的作用激發(fā)機(jī)體的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)抗腫瘤的免疫應(yīng)答。如卡介苗、短小棒狀桿菌、左旋咪唑等，也可用細(xì)胞因子如白介素-2、白介素-4、干擾素、腫瘤壞死因子等。但由于肺癌的腫瘤抗原性不強(qiáng)，目前這種治療難以取得明顯效果。（2）特異性主動免疫療法：隨著對腫瘤免疫研究的深入，腫瘤疫苗和抗獨特性抗體作為疫苗的發(fā)現(xiàn)使特異性主動免疫療法成為可能[9]。某些抗獨特性抗體與抗體上的抗原相關(guān)位點結(jié)合，能夠模擬外來抗原，作為免疫治療中替代性抗原。

52被動免疫療法主要有過繼免疫療法和抗體療法。（1）過繼免疫療法：目前肺癌的過繼免疫療法可以應(yīng)用淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞（LAK）輸入體內(nèi)或局部應(yīng)用于癌性胸水，對延緩病情的發(fā)展有一定的效果，但單獨應(yīng)用治療效果不佳。還可以應(yīng)用腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞（TIL），通過基因修飾的TIL進(jìn)行治療。實踐證明TIL的療效比LAK要更好。（2）抗體療法：目前抗體療法正成為肺癌的另一研究熱點，它已成為肺癌綜合治療的一部分。運(yùn)用相應(yīng)的單克隆抗體與異常表達(dá)的癌基因產(chǎn)物結(jié)合可以阻斷癌細(xì)胞的異常信號傳導(dǎo)通路，從而阻止癌癥的發(fā)展[10]。

6介入治療

目前介入治療在NSCLC應(yīng)用的方法主要有兩種，即經(jīng)支氣管動脈灌注化療和支氣管栓塞治療。經(jīng)支氣管動脈灌注化療可有效提高腫瘤局部藥物濃度，提高抗癌藥物的解毒作用，同時又可以減少或阻斷腫瘤的血供，使其縮小、壞死。支氣管栓塞治療可通過介入放支架解除腫瘤引起的中心氣道狹窄或阻塞，對繼發(fā)于肺癌的上腔靜脈綜合征患者血管內(nèi)置人支架是較好的方法。

7基因治療

基因治療在該病所應(yīng)用的方法主要有[11]誘導(dǎo)特異性免疫的基因治療和直接作用的基因治療兩種。誘導(dǎo)特異性免疫的基因治療即輸送生物活性基因來改變癌細(xì)胞的局部免疫環(huán)境，增加癌細(xì)胞的免疫原性和T細(xì)胞的反應(yīng)性，改善抗原提呈和提供缺失的旁分泌。由于免疫性誘導(dǎo)是遺傳性系統(tǒng)性的，同時靶子來源于腫瘤抗原，因此所誘導(dǎo)的免疫性具有潛在發(fā)現(xiàn)和殺死沒有經(jīng)過基因修改的腫瘤細(xì)胞。這一特點可能對以遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移為主要問題的肺癌具有重要意義。直接作用的基因治療主要有抑癌基因的治療、藥敏感性基因治療和反義cDNA和寡核苷酸技術(shù)3種方法。

8中醫(yī)藥治療

中醫(yī)學(xué)側(cè)重辨證施治，從整體調(diào)節(jié)入手，目前中醫(yī)藥在治療肺癌中，特別是在NSCLC的防治方面主要有以下作用：（1）防治手術(shù)、放療、化療副反應(yīng)；（2）配合手術(shù)、放療、化療減毒增效；（3）在抗非小細(xì)胞肺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的綜合治療中起很重要的作用；（4）不能手術(shù)、放療，不宜再化療的肺癌患者，中醫(yī)起主導(dǎo)作用，即改善癥狀、提高生存質(zhì)量、延長生存期[12]。

81病因病機(jī)中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，肺癌屬“肺積”“痞癖”“咳嗽”“咯血”“胸痛”等范疇，病位在肺。學(xué)者們對其病因病機(jī)雖然有不同的認(rèn)識，但無外乎正氣虛損和邪毒內(nèi)積兩個方面，本病病變部位在肺，與脾、腎有關(guān)，病理因素主要為氣滯、痰濁、瘀血、熱毒，病理性質(zhì)為本虛標(biāo)實，虛實錯雜。在治療過程中，扶正培本為其關(guān)鍵。

劉麗坤等[13]認(rèn)為，肺癌的基本病機(jī)為正虛邪實。正虛是肺癌發(fā)生的基礎(chǔ)，是復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵，其中肺陰虧虛貫穿疾病的始終，痰瘀毒結(jié)是肺癌的主要病理表現(xiàn)。劉嘉湘認(rèn)為肺癌總屬本虛標(biāo)實，由于正氣先傷，邪氣得以乘虛而入，聚積于肺，導(dǎo)致氣滯血瘀、聚液為痰、痰瘀交阻而漸成腫塊。高萍等認(rèn)為放化療副反應(yīng)是毒邪內(nèi)侵，損害肝脾腎等臟腑功能，耗傷機(jī)體氣血津液，導(dǎo)致氣血陰陽的失調(diào)與缺失。

82辨證分型中醫(yī)將肺癌看作是全身性疾病的一個局部表現(xiàn)，主要根據(jù)癥狀和體征對肺癌進(jìn)行辨證分型，治療上強(qiáng)調(diào)全面調(diào)整人體機(jī)能。目前主要依據(jù)陰陽盛衰、氣血的虛實、臟腑病機(jī)以及邪毒性質(zhì)進(jìn)行歸類分型。這些證型基本反映了肺癌病情發(fā)展不同階段的一些規(guī)律。劉嘉湘對405例非小細(xì)胞肺癌病例進(jìn)行研究，其中陰虛和氣陰兩虛型占肺癌的726%，指出肺癌的病機(jī)特點以陰虛和氣陰兩虛為主。楊國旺等將肺癌劃分為氣虛、陰虛、陽虛、血虛、痰濕、血瘀、毒熱7個基本證型。李忠等研究發(fā)現(xiàn)以氣陰兩虛及痰瘀互阻證型最為常見，其他依次為脾虛痰濕、肺脾氣虛、氣虛血瘀、痰濕阻滯等。孫士玲分為肺脾氣虛、肺，胃陰虛、肺熱痰濕、氣滯血瘀型。

83中成藥中醫(yī)藥作為一個輔助療法，在非小細(xì)胞肺癌的治療中起到了很大的作用。隨著中藥制劑現(xiàn)代化研究，研制成了很多中成藥，有很好的臨床療效。目前臨床上使用的口服中成藥有固本消瘤膠囊、乾坤膠囊、平消膠囊、抗瘤沖劑、仙露沖劑、中成藥鶴蟾片、參一膠囊等。治療NSCLC的中藥靜脈制劑主要有康萊特注射液、參麥注射液、丹參注射液、艾迪注射液、華蟾素、欖香烯、巖舒注射液等。

9回顧與展望

非小細(xì)胞肺癌的手術(shù)、放療、化療和生物治療等在臨床治療上已經(jīng)取得了很大的進(jìn)步，但是治療效果仍不能令人滿意。中醫(yī)藥作為一個補(bǔ)充治療手段和方法正起到越來越重要的作用。中醫(yī)的整體觀從大局出發(fā)，提倡提高機(jī)體正氣抗邪，防止病情進(jìn)展，正彌補(bǔ)了西醫(yī)重局部的不足。中醫(yī)藥治療肺癌的療效以病灶穩(wěn)定率較高、生存期較長、改善生活質(zhì)量較好為主要特點，在抗復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，減負(fù)增效方面有一定的優(yōu)勢，對于已無放化療機(jī)會晚期肺癌患者，中醫(yī)藥治療是緩解疾苦的主要手段。但是中醫(yī)治療在很多方面還不完善，比如辨證分型缺乏統(tǒng)一的認(rèn)識，臨床應(yīng)用個案報道數(shù)量較多，缺乏大樣本、多因素的觀察，循證醫(yī)學(xué)證據(jù)并不充分等。

筆者認(rèn)為目前西醫(yī)治療一方面微創(chuàng)手術(shù)研究是未來外科手術(shù)的發(fā)展方向，另一方面靶向治療、免疫治療和基因治療都是肺癌多學(xué)科治療中新的研究和應(yīng)用熱點，日益受到重視，是以后發(fā)展的方向。要注意提高藥物療效，降低毒副作用，延長患者（尤其是晚期肺癌患者）的生存期。中醫(yī)治療應(yīng)從扶正祛邪，整體調(diào)節(jié)入手，應(yīng)特別重視調(diào)補(bǔ)肺臟功能兼顧調(diào)整五臟功能。具體來說，整體方面要調(diào)理飲食，注意飲食平衡；調(diào)理藥物，注意藥物之間的平衡，勿太過不及；調(diào)理五臟功能，勿偏盛偏衰。局部方面要注意調(diào)整肺臟本身的功能和調(diào)整脾胃功能。中醫(yī)認(rèn)為“人以胃氣為本”、“脾胃為后天之本，為氣血生化之源”，脾胃功能好壞對疾病的預(yù)防和治療都有很重要的作用，尤其在肺癌的防治中更是具有重要價值。未來該病的治療必將走上一條中西醫(yī)互補(bǔ)的道路，因而希望能夠多學(xué)科配合、大膽摸索、反復(fù)實踐，更好的發(fā)揮中西醫(yī)結(jié)合在NSCLC預(yù)防治療中的特色和優(yōu)勢，從而對人類防治NSCLC整體水平的提高起到積極地推動作用。

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第3篇

【摘要】 目的: 探討?zhàn)ぶ呒っ?FAK)表達(dá)水平對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖及運(yùn)動的影響。方法: 針對FAK基因不同靶點設(shè)計siRNA序列， 構(gòu)建siRNA重組子， 轉(zhuǎn)染Caco2細(xì)胞， 以RTPCR和免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測FAK mRNA和蛋白表達(dá)變化及時間效應(yīng)， 同時檢測FAK基因敲低對Caco2細(xì)胞的凋亡、 增殖及遷移的影響。結(jié)果: FAK siRNA導(dǎo)入Caco2細(xì)胞后， FAK mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)， 細(xì)胞增殖及遷移能力受抑， 呈時間依賴關(guān)系， FAK mRNA水平下調(diào)在轉(zhuǎn)染后48 h達(dá)到最大。結(jié)論: FAK siRNA可有效抑制靶基因表達(dá)， FAK表達(dá)水平下調(diào)后Caco2細(xì)胞的增殖及運(yùn)動明顯受抑制。

【關(guān)鍵詞】 小干擾RNA; 結(jié)直腸癌; FAK; 細(xì)胞增殖; 細(xì)胞運(yùn)動

[Abstract] AIM: To investigate the effect of siRNA targeting FAK gene on proliferation and motility of colorectal cancer. METHODS: Recombinant plasmids that produced siRNAs targeting FAK were designed and cloned， then transfected into Caco2 cells. The changes of FAK expression levels were examined by RTPCR and immunocytochemistry. The effects of FAK gene knockdown on apoptotic morphological changes， proliferation， and motility were investigated. RESULTS: Recombinant plasmids targeting FAK were successfully constructed， FAK mRNA and protein level was silenced in Caco2 cells significantly. The inhibition of mRNA level was achieved maximal at 48 h post transfection with time dependent. The ability of proliferation and motility of Caco2 cells were significantly decreased. CONCLUSION: Plasmidmediated FAK siRNA could inhibit FAK gene expression. The proliferation， motility and apoptosis were inhibited effectively， which suggested that FAK expression is closely associated with the proliferation， motility and apoptosis， etc. The results may be used as the reference for gene therapy of colorectal cancer.

[Keywords]small interfering RNA; colorectal cancer; FAK; cell proliferation; cell motility

近年來以黏附相關(guān)因子為靶點的治療成為基因治療研究的新策略[1]， 黏著斑激酶(focal adhesion kinase， FAK)是近年來發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞黏附介導(dǎo)的信號通路的重要因子， 作為胞內(nèi)信號蛋白酪氨酸激酶， 于1992年被獨立鑒定為Src癌基因的底物。FAK的相對分子質(zhì)量(Mr)為125 000， 定位于人染色體8q24， 與cmyc基因座接近， 此基因座在人癌細(xì)胞中往往被激活而強(qiáng)化[2]。FAK作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵分子， 可傳遞由胞外到胞內(nèi)的多種信號， 其在結(jié)腸癌中表達(dá)升高而在正常組織細(xì)胞中表達(dá)呈弱陽性的特點開始引起研究人員的關(guān)注[3]。有研究顯示， FAK基因在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)升高[4]， 并與癌細(xì)胞增殖、 侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)， 但作用機(jī)制還不明確。本實驗將靶向FAK基因的siRNA表達(dá)載體導(dǎo)入Caco2細(xì)胞， 探索FAK siRNA對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和遷移的影響并初步探討其作用機(jī)制， 為結(jié)直腸癌基因治療積累實驗資料。

1 材料和方法

1.1 材料 人結(jié)直腸癌細(xì)胞株Caco2購于美國ATCC。重組質(zhì)粒pU6H1GFP/FAKsiRNA為本實驗室設(shè)計、 百奧生物技術(shù)有限公司(南通)構(gòu)建， 大小為5.5 kb， 經(jīng)測序正確。限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ購自NEB公司。脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、 TRIzol試劑均為美國Invitrogen公司產(chǎn)品。RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司。胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司。四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)購自美國Amresco公司。RT007 AMV反轉(zhuǎn)錄酶購自杭州博日科技有限公司。FAK、 GAPDH引物由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。針對FAK的單克隆抗體(mAb)購自Santa Cruz公司。SP免疫組化試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。Hoechst 33258購自南京凱基基因有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 siRNA的設(shè)計及構(gòu)建 利用Ambion siRNA在線軟件設(shè)計了2條針對FAK的siRNA: siFAK1: 5′GGGCAGACGAGACCACACTGA3′; siFAK2: 5′GAAATGGAAGAAGATCAGCGCT3′; 錯義對照序列siRNASCR: 5′GCATCTAAGGTATCGTTGTGGCTC3′。經(jīng)Blast比對證實與人其它基因無同源性后構(gòu)建合成siRNA表達(dá)載體， 雙啟動子U6和H1之間插入人FAK及錯義siRNA靶序列。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 于6孔培養(yǎng)板， 將Caco2細(xì)胞接種于無抗生素、 含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液， 細(xì)胞接種密度: 2×105/孔， 飽和濕度培養(yǎng)24 h。參照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染優(yōu)化， 轉(zhuǎn)染后6 h更換完全培養(yǎng)基。實驗分為: 正常對照組(未轉(zhuǎn)染的Caco2)、 錯義siRNASCR組(非特異性siRNA轉(zhuǎn)染)、 干擾組siFAK1、 siFAK2。

1.2.3 GFP表達(dá)檢測及轉(zhuǎn)染效率評價 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞于激發(fā)波長為488 nm的熒光倒置顯微鏡下檢測GFP的表達(dá)情況。以放大100倍的視野為標(biāo)準(zhǔn)， 計5個視野表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)， 求GFP表達(dá)率: GFP表達(dá)率=發(fā)綠色熒光細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.4 細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測 取對數(shù)生長期細(xì)胞以2×105/孔接種于鋪有無菌蓋玻片的6孔板中， 每組爬片4張， 轉(zhuǎn)染48 h后棄培養(yǎng)液， PBS洗3次， 40 g/L多聚甲醛4℃固定15 min， PBS洗3次， 吸凈液體， 每孔加入200 μL Hoeschst 33258工作液， 避光孵育10 min， PBS漂洗封片， 熒光顯微鏡下隨機(jī)選取高倍視野進(jìn)行拍照， 激發(fā)光波長為365 nm。

1.2.5 RTPCR檢測 收集轉(zhuǎn)染后24、 48、 72、 96 h細(xì)胞， 各組細(xì)胞總RNA按TRIzol試劑說明書提取。將總RNA(0.5 μg)行10 μL反轉(zhuǎn)錄體系。取cDNA再進(jìn)行25 μL PCR反應(yīng)。PCR循環(huán)參數(shù)為: 95℃預(yù)變性2 min; 94℃變性40 s， 46℃退火40 s， 72℃延伸1 min， 共28個循環(huán)(GAPDH: 18個循環(huán))， 于72℃延伸10 min。FAK上游引物: 5′GCGTCTAATCCGACAGCA3′， 下游引物: 5′GCCGACTTCCTTCACCAT3′， 擴(kuò)增產(chǎn)物為445 bp; 內(nèi)參GAPDH上游引物: 5′AATCCCATCACCATCTTCCA3′， 下游引物: 5′CCTGCTTCACCACCTTCTTG3′， 擴(kuò)增產(chǎn)物為580 bp。各取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物， 經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳， 凝膠成像儀下觀察結(jié)果及照相， BandScan 5.0進(jìn)行條帶分析， 檢測各組FAK與GAPDH的灰度比值表示FAK mRNA表達(dá)水平變化， 比值越高說明目的基因表達(dá)越高。

1.2.6 細(xì)胞增殖檢測 調(diào)整細(xì)胞密度為6 000個/孔， 接種至96孔板， 設(shè)Blank組(只加完全RPMI1640培養(yǎng)液)、 siRNASCR組、 正常對照組、 干擾組(siFAK1、 siFAK2)， 每組每個時間點設(shè)6個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后棄上清， 進(jìn)行轉(zhuǎn)染(脂質(zhì)體: 0.5 μL， DNA: 0.2 μg)。于孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、 48、 72、 96 h后每孔加入MTT(1 g/L)15 L， 37℃、 50 mL/L CO2避光孵育5 h， 再加入100 μL DMSO振蕩10 min， 酶標(biāo)儀562 nm處測定各孔A值。生長抑制率=(1-處理組平均A值)/正常對照組平均A值×100%。

1.2.7 細(xì)胞遷移檢測 于6孔板內(nèi)按上述方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染， 培養(yǎng)24 h后用外接真空泵的1 mL移液槍頭(直徑1.5 mm)垂直于6孔板板底分別打孔， PBS清洗2次， 更換完全培養(yǎng)液。分組同1.2.2， 40倍倒置顯微鏡下照相。于轉(zhuǎn)染后48、 72、 96、 120 h繼續(xù)照相， Gene Tools軟件測定每孔各時間點面積。遷移率=(1-該時間點損傷面積)/原始損傷面積×100%。

1.2.8 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測 將細(xì)胞接種于鋪有無菌蓋玻片的6孔板中(1.5×105/孔)， 每組爬片4張。設(shè)陰性對照組(PBS代替一抗)、 siRNASCR組、 正常對照組、 siFAK1和siFAK2共5組。轉(zhuǎn)染48 h后取蓋玻片用SP試劑盒檢測， FAK mAb稀釋度為1∶300， 避光條件下， DAB顯色， 三蒸水沖洗停顯， 梯度酒精脫水， 二甲苯透明， 取出蓋玻片置于載玻片上， 胞質(zhì)出現(xiàn)棕褐色為陽性染色。中性樹膠封片后， 每組隨機(jī)選取10個高倍視野(×200)， 進(jìn)行圖像采集。

1.2.9 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)以x±s表示， 采用SPSS15.0軟件進(jìn)行方差分析。P

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pU6H1GFP酶切鑒定 用Omega無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒擴(kuò)增并純化質(zhì)粒， 經(jīng)Hind Ⅲ 酶切鑒定， 可見質(zhì)粒可被切割成大約5.5 kb的線性片段， 結(jié)果完全正確(圖1)。

2.2 轉(zhuǎn)染效率 經(jīng)優(yōu)化的脂質(zhì)體條件轉(zhuǎn)染后， GFP表達(dá)率為(44.59±2.71)%。

2.3 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察 經(jīng)Hoechst 33258染色可見正常對照組細(xì)胞染色質(zhì)為彌漫均勻的低強(qiáng)度熒光， 無明顯凋亡特征(圖2A); 經(jīng)siFAK1和siFAK2組轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后， 細(xì)胞表現(xiàn)出典型的凋亡形態(tài)學(xué)變化， 胞核呈濃染致密的固縮形態(tài)、 斷裂成塊、 呈顆粒狀亮藍(lán)色熒光， 且有少量凋亡小體出現(xiàn)(圖2D、 E中箭頭所示)。脂質(zhì)體組及siRNASCR組均沒有出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)學(xué)改變(圖2B、 C)。因此可得出脂質(zhì)體試劑及pU6H1GFP載體對轉(zhuǎn)染無明顯影響， 排除假陽性的干擾。

2.4 FAK mRNA表達(dá)變化 轉(zhuǎn)染Caco2細(xì)胞于24、 48、 72、 96 h后檢測siRNA敲低FAK mRNA水平表達(dá)的時間效應(yīng)關(guān)系， 并確定敲低效果最好的1條序列。RTPCR結(jié)果顯示， 各組內(nèi)相應(yīng)內(nèi)參GAPDH的條帶基本一致， siFAK1和siFAK2組FAK mRNA水平低于正常組和siRNASCR組， 且敲低效應(yīng)在轉(zhuǎn)染后24～48 h范圍內(nèi)呈時間依賴性降低， 至48 h降到最低(P

2.5 細(xì)胞增殖狀況 MTT法檢測表明， siFAK1和siFAK2組細(xì)胞增殖抑制率明顯增加(圖4)。與正常對照組相比， siFAK1和siFAK2對細(xì)胞增殖的抑制率在轉(zhuǎn)染后24～72 h均有統(tǒng)計學(xué)意義(P

2.6 細(xì)胞遷移狀況 與正常組相比， 特異性siFAK1、 siFAK2組使Caco2細(xì)胞的遷移率明顯降低(P

2.7 FAK蛋白表達(dá)變化 免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測結(jié)果顯示， 正常組FAK表達(dá)多位于胞質(zhì)， 呈棕褐色， 強(qiáng)陽性表達(dá)， 而siFAK1、 siFAK2組細(xì)胞中FAK蛋白的表達(dá)明顯減弱(圖6)。ImagePro Plus 6.0圖像分析各組的A值， 轉(zhuǎn)染后48 h siRNASCR組、 正常對照組、 siFAK1及siFAK2光密度分析結(jié)果分別為0.223±0.006、 0.254±0.002、 0.059±0.006、 0.079±0.008?？梢娹D(zhuǎn)染后48 h兩個干擾組的蛋白表達(dá)明顯被抑制(P

3 討論

FAK作為Src癌基因的底物， 位于整合素富集的黏著斑處， 與多種信號分子相互作用， 介導(dǎo)多種細(xì)胞表面受體激活及信號傳輸來調(diào)控細(xì)胞骨架組建、 細(xì)胞增殖、 凋亡及存活、 細(xì)胞轉(zhuǎn)移及入侵等， 最終參與腫瘤的發(fā)生。有研究表明， 在正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞中FAK表達(dá)呈弱陽性或陰性[5]， 這與維持上皮細(xì)胞的生理功能是不可缺少的; 而在結(jié)直腸癌相關(guān)的細(xì)胞中FAK表達(dá)明顯升高， 說明其表達(dá)上調(diào)可能是結(jié)直腸癌具有惡性表型的早期事件。因此， FAK作為腫瘤發(fā)生進(jìn)程相關(guān)的關(guān)鍵分子可能成為腫瘤治療的靶點， 而抑制FAK的表達(dá)則有望成為腫瘤基因治療的新熱點。針對FAK基因的反義寡核苷酸治療結(jié)直腸癌的研究已有報道[6]。RNAi是近年來快速發(fā)展的一種高效的基因沉默技術(shù)， 并作為一種關(guān)鍵技術(shù)應(yīng)用于抗腫瘤、 基因功能研究[7]。

本實驗以Caco2細(xì)胞為研究對象， 采用針對FAK mRNA的特異性siRNA重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。RTPCR顯示， 所設(shè)計的兩個siFAK重組質(zhì)粒均能使其mRNA水平下降， 其中以siFAK1干擾效果更強(qiáng)， 在轉(zhuǎn)染后48 h敲低效果最明顯， 說明siRNA對FAK的抑制作用可能有時相性。而錯義組則沒有上述作用， 從而另一方面證明RNA干擾的特異性。同時免疫細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)果也顯示轉(zhuǎn)染后48 h siFAK1對細(xì)胞FAK蛋白抑制更明顯。

細(xì)胞增殖和遷移在多種惡性腫瘤的病理生理過程中起重要作用。有研究表明[8]， 活化的FAKRASMAPK是促進(jìn)細(xì)胞遷移和增殖的重要信號通路。本研究中， 細(xì)胞增殖及遷移實驗表明， 靶向FAK基因干擾Caco2細(xì)胞后， 細(xì)胞貼壁能力降低， 變圓易脫落， 細(xì)胞的增殖及遷移明顯受抑， 因此我們推測FAK基因表達(dá)受抑可使FAKRASMAPK信號通路受阻， 最終導(dǎo)致細(xì)胞增殖及遷移能力降低， 提示FAK基因可能是結(jié)直腸癌腫瘤治療的一個新靶點。相反siRNASCR組對細(xì)胞的增殖及遷移無明顯影響， 因此可以斷定質(zhì)粒載體pU6H1GFP可以作為安全有效的基因載體。近年來有關(guān)研究表明FAK與腫瘤細(xì)胞的凋亡相關(guān)。Huang等[9]發(fā)現(xiàn)FAK通過活化PI3K/Akt及MAPK/ERK1/2信號存活通路而引發(fā)NFκB活化， 最終阻斷caspase3級聯(lián)反應(yīng)， 使細(xì)胞凋亡受抑。因此FAK的表達(dá)與凋亡密切相關(guān)。本實驗初步研究結(jié)果顯示， 通過Hoechst熒光染色發(fā)現(xiàn)siFAK轉(zhuǎn)染Caco2細(xì)胞48 h后細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)變化: 核致密濃縮， 染色體斷裂， 并出現(xiàn)凋亡小體等特征。從分子機(jī)制來說， FAKsiRNA可能通過下調(diào)FAK mRNA和蛋白表達(dá)水平而促使Caco2細(xì)胞凋亡。

實驗中2個siFAK重組質(zhì)粒對靶基因的抑制效應(yīng)不同， 其中以siFAK1抑制FAK基因mRNA、 增殖及遷移的作用最為明顯， 這種針對同一基因的不同靶點而產(chǎn)生的不同干擾效果， 可能與位置效應(yīng)有關(guān)[10]。因此說明利用RNA干擾進(jìn)行腫瘤臨床治療要對干擾序列進(jìn)行篩選。

綜上所述， FAK與腫瘤的發(fā)生、 發(fā)展密切相關(guān)， 我們的初步研究結(jié)果表明， 干擾FAK基因表達(dá)后使Caco2細(xì)胞增殖、 遷移力明顯減緩、 細(xì)胞出現(xiàn)凋亡等現(xiàn)象， 且FAK基因表達(dá)受抑后胞質(zhì)形態(tài)結(jié)構(gòu)受損， 其機(jī)制可能與抑制Caco2細(xì)胞FAK mRNA和蛋白表達(dá)水平有關(guān)。因此靶向抑制FAK基因的表達(dá)， 可能是結(jié)直腸癌治療的有效途徑。此研究為RNAi在腫瘤治療方面奠定了實驗基礎(chǔ)， 也為臨床研究和進(jìn)一步的治療研發(fā)提供了更多的依據(jù)。

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第4篇

最近，有關(guān)腫瘤發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制的研究表明，在惡性腫瘤細(xì)胞中，細(xì)胞內(nèi)的各種基本過程是調(diào)節(jié)失控。這些過程包括：細(xì)胞周期的調(diào)控，信號傳遞通路的阻斷，細(xì)胞凋亡等。研究者將注意力轉(zhuǎn)向癌的病因?qū)W與病理過程中起作用的特異的分子及生物靶點。如細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑、信號傳導(dǎo)阻滯劑、血管生成抑制劑、化療與放療保護(hù)劑的尋找。

1 細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑

細(xì)胞凋亡是在基因調(diào)控下發(fā)生的細(xì)胞自殺行為。細(xì)胞在各種因素如DNA損傷藥物、生長因子撤出等作用下，Bcl-2、p53、C-myc、p21等細(xì)胞凋亡調(diào)控基因的表達(dá)發(fā)生改變，同時引起一系列生化變化，如胞內(nèi)Ca2+水平升高，pH值下降，某些蛋白酶活性增高，最終發(fā)生細(xì)胞凋亡，已有越來越多的證據(jù)表明細(xì)胞凋亡與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、治療及預(yù)后密切相關(guān)。

Bcl-2的過度表達(dá)使腫瘤細(xì)胞對一系列細(xì)胞毒化療藥物耐受性增加，p53缺失的小鼠對DNA損傷性藥物同樣表現(xiàn)高度抗性。因此，可以制定一種聯(lián)合化療的策略，一種藥物抑制細(xì)胞凋亡抑制蛋白(Bcl-2，Bcr-Abl)，降低Bcr-abl的表達(dá)，使Bcl-2失活，干擾其與Bax的結(jié)合，恢復(fù)p53功能；另一種細(xì)胞毒藥物，以遠(yuǎn)低于通常所用的劑量直接殺傷腫瘤細(xì)胞，已得到實驗證明是可行的。細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高在多種藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中有重要作用，因此人為地調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，提高腫瘤細(xì)胞對凋亡誘導(dǎo)劑的敏感性，也是一種有效的治療方法。這一療法將為治療非雄激素依賴的前列腺癌展示了美好前景。

2 信號傳導(dǎo)阻滯劑

目前，研究腫瘤細(xì)胞信號傳導(dǎo)機(jī)制，選擇性阻斷腫瘤細(xì)胞自分泌或旁分泌的信號傳導(dǎo)通路，破壞其自控性生長調(diào)節(jié)機(jī)制，正在成為極具吸引力的研究熱點。一方面可以通過阻斷生長促進(jìn)因子或增強(qiáng)生長抑制因子的作用，使腫瘤細(xì)胞的生長減慢或停止，另一方面也可以通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的分化，恢復(fù)其正常的生長調(diào)節(jié)機(jī)制而改變其惡性表型。這兩方面的作用均可通過選擇性地調(diào)變腫瘤細(xì)胞信號傳導(dǎo)系統(tǒng)的不同組分而達(dá)到。這與經(jīng)典的細(xì)胞毒性抗癌藥物相比，具有選擇性強(qiáng)、毒副作用小、不受細(xì)胞產(chǎn)生抗藥性的影響等優(yōu)點，尤其對晚期腫瘤或轉(zhuǎn)移癌可能具有獨到的療效，很有希望成為新一代抗癌藥物。因此研究腫瘤細(xì)胞信號傳導(dǎo)機(jī)制具有潛在的應(yīng)用價值和意義。細(xì)胞信號傳導(dǎo)藥物的作用方式可根據(jù)不同情況選擇：

2．1 多數(shù)情況下，正常的細(xì)胞信號傳導(dǎo)機(jī)制在腫瘤細(xì)胞中過度活躍，或正常信號分子過度表達(dá)。此時可通過部分阻斷過度激活的細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑，或抑制過度表達(dá)的信號分子的方法，使腫瘤細(xì)胞生長速度減慢，直至接近正常細(xì)胞水平。

2．2 在某些情況下，腫瘤細(xì)胞中的信號分子選擇性激活，使得細(xì)胞信號傳導(dǎo)發(fā)生異常?？梢岳眠@個特點，選擇性地調(diào)變腫瘤細(xì)胞中的PKC亞型。許多腫瘤中可見不同的酪氨酸激酶受體的過度表達(dá)或過度激活，如上皮細(xì)胞腫瘤中常見EGFR家族受體的過度表達(dá)，血液細(xì)胞腫瘤中常見IGFR家族受體的過度表達(dá)，膠質(zhì)瘤中常見PDGFR家族受體的過度表達(dá)等。因此，阻斷酪氨酸激酶受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)將抑制腫瘤的生長。

細(xì)胞信號傳導(dǎo)抑制劑幾乎是與基因治療同步進(jìn)入腫瘤臨床治療實驗的。腫瘤細(xì)胞信號傳導(dǎo)藥物將是抗癌藥物研究的一個重要方向。

3 血管生成抑制劑

從癌前病變到侵襲，癌發(fā)展階段伴隨著血管生成。目前已經(jīng)闡明新生血管形成的機(jī)制，無疑為抗腫瘤藥的發(fā)現(xiàn)提供了新的靶點，現(xiàn)已明確至少有12種血管生成促進(jìn)劑和抑制劑，包括：血管內(nèi)皮生長因子、FGF、血管生成劑等。這些因子在許多人、鼠腫瘤及正常組織中均有表達(dá)；同時，在腫瘤及正常組織中抗血管生成因子也有表達(dá)，這表明血管生成的調(diào)控有賴于正、負(fù)信號的相對平衡，這種平衡的失調(diào)便導(dǎo)致新的血管生成。

許多血管生成抑制劑已進(jìn)入臨床試驗，包括TNP-470， Marimastat，干擾素(INF)α2a等。其中INFα-2a為第一個應(yīng)用于臨床，用以治療晚期兒童血管瘤，第二代更為有效的內(nèi)源性血管生成抑制劑，如Endostatin和可溶性VEGF受體均已進(jìn)入臨床試驗。這些效果很好的血管生成抑制劑均需長期服藥才能在動物模型上抑制血管生成以引起腫瘤減退，臨床療效有待證實。但無論如何，血管生成抑制劑是抗癌藥物研究領(lǐng)域一個頗有前景的發(fā)展方向。

4 化療與放療保護(hù)劑

最新的研究進(jìn)展表明，p53基因與腫瘤化療和放療所引起的副作用有著密切的關(guān)系。自1989年以來，人們在越來越多的不同類型的腫瘤中發(fā)現(xiàn)了p53基因的突變，其頻率可達(dá)50-60%，突變的形式可表現(xiàn)為點突變、缺失突變、插入突變、移碼突變、基因重排等。存在p53突變的腫瘤包括胃癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌、乳腺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、肺癌、前列腺癌、肝癌、膠質(zhì)細(xì)胞瘤、軟組織肉瘤等大多數(shù)實體瘤。目前臨床上常用的抗腫瘤藥如紫杉醇、阿糖胞苷等以及放療所采用的UV射線、g射線等均被認(rèn)為是通過誘導(dǎo)p53基因依賴性的細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用。新近研究表明，在小鼠的一些正常組織如淋巴組織、造血器官、腸上皮、等均有p53高表達(dá)，而這些組織也正是許多抗腫瘤藥物易損傷的部位，也即多數(shù)抗腫瘤藥產(chǎn)生副作用的敏感器官，如白細(xì)胞減少、血小板減少、造血功能降低、胃腸道反應(yīng)等等。

5 藥物基因組學(xué)

第5篇

【關(guān)鍵詞】 治療性克隆；細(xì)胞核;移植；胚胎干細(xì)胞

1治療性克隆概述

治療性克隆（therapeutic cloning）是體細(xì)胞核移植技術(shù)和最新的人胚胎干細(xì)胞技術(shù)結(jié)合的產(chǎn)物，將成為人類醫(yī)療歷史上革命性的技術(shù). 該技術(shù)首先應(yīng)用患者體細(xì)胞，如皮膚細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，作為核供體，移植入去核的人卵母細(xì)胞，獲得克隆胚胎；然后從克隆胚胎分離建立胚胎干細(xì)胞系；并將這些胚胎干細(xì)胞在一定條件下，誘導(dǎo)分化成所需要的各種類型的細(xì)胞用于治療目的［1，2］. 目前已報道，將產(chǎn)生多巴胺的神經(jīng)元細(xì)胞用于治療帕金森癥［3］，將產(chǎn)生胰島素的胰島細(xì)胞治療糖尿病患者［4］. 從理論上來說由于使用的是患者自身的細(xì)胞生產(chǎn)出來的治療用細(xì)胞，移植這些細(xì)胞到患者體內(nèi)將不會產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng). 另一方面，每年都有數(shù)以百萬計的患者需要細(xì)胞、組織的修復(fù)或者器官移植，由于胚胎干細(xì)胞可以無限傳代，在數(shù)量上可以保證治療的需要，從而解決可供移植的細(xì)胞、組織和器官來源嚴(yán)重不足的瓶頸問題［5］，為人類健康和長壽提供了新的希望.

近年來，利用核移植技術(shù)和胚胎干細(xì)胞技術(shù)相繼建立了人核移植胚胎干（nuclear transfer embryonic stem cell，ntES）細(xì)胞系和人兔異種間ntES細(xì)胞. 這2項階段性研究成果的取得，標(biāo)志著治療性克隆研究的巨大進(jìn)步. 韓國科學(xué)家Hwang等［6］通過核移植技術(shù)獲得了人人ntES細(xì)胞. 他們以健康女性志愿者的體細(xì)胞為核供體，以其自身卵母細(xì)胞為受體. 在30枚核移植囊胚中，得到20個內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICMs），建成1株人 ntES細(xì)胞系，可傳代培養(yǎng)70 代以上. 上海第二醫(yī)科大學(xué)盛惠珍研究小組［7］在國際上首次構(gòu)建了人兔核移植重構(gòu)胚. 分別將5，42，52和60歲4個年齡組的人皮膚成纖維細(xì)胞核移入去核兔卵母細(xì)胞內(nèi)，獲得ntES細(xì)胞，通過原位雜交、免疫組化、核型和同源基因分析等證實 ntES細(xì)胞具有人源性，并且保持干細(xì)胞的未分化特性，能形成類胚體，在一定誘導(dǎo)條件下可以分化為神經(jīng)、肌肉等3個胚層的細(xì)胞群. 200506，漢城國立大學(xué)的研究者［8］以患者的皮膚細(xì)胞為供體，以志愿者捐贈的卵母細(xì)胞為受體，利用體細(xì)胞核移植技術(shù)成功建立11株人核移植胚胎干細(xì)胞，這些細(xì)胞具有多能性，染色體正常，與供核患者的DNA一致、組織相容性抗原一致.

2治療性克隆的應(yīng)用前景

ES細(xì)胞在生物醫(yī)學(xué)的各個領(lǐng)域均有廣闊的應(yīng)用前景，ntES細(xì)胞也有著同樣廣闊的前景，為臨床治療學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物發(fā)育學(xué)、比較動物學(xué)等研究提供研究材料和方法.

2.1臨床疾病的治療ntES細(xì)胞與普通的細(xì)胞移植治療相比，具有革命性的進(jìn)步. 它以患者的體細(xì)胞為核供體，通過核移植技術(shù)獲得的ntES細(xì)胞，與患者的遺傳物質(zhì)相同，可以消除受體對供體的免疫排斥反應(yīng)，為目前多種退形性疾病，如心臟病、脊髓損傷、帕金森病、1型糖尿病等的治療帶來了新的希望. 特別是一些目前還沒有找出致病基因的遺傳病，如脊髓側(cè)索硬化癥，ntES細(xì)胞移植是最有希望的治療方法. 目前已經(jīng)應(yīng)用ntES細(xì)胞在體內(nèi)外分化成多種細(xì)胞，包括神經(jīng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞［9，10］. 尤其Barberi等［9］建立了一套方法，能使 ntES細(xì)胞向中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞特定分化，能產(chǎn)生高效率的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、寡突細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞，包括多巴胺能神經(jīng)元、γ氨基丁酸能神經(jīng)元等，將分化的多巴胺能神經(jīng)元移植到 Parkinson病模型后，能改善其癥狀. 細(xì)胞治療的途徑有兩種：其一，ntES細(xì)胞定向分化后移植. 細(xì)胞擴(kuò)增后，體外定向分化，對分化細(xì)胞進(jìn)行純化，將獲得的目的細(xì)胞移植到病變部位，替代喪失功能的部分細(xì)胞；其二，ntES細(xì)胞原位移植. 與定向分化后相比，ntES細(xì)胞原位移植有以下缺點：①沒有經(jīng)過純化，可能將污染的異源飼養(yǎng)層細(xì)胞帶進(jìn)移植部位；②ntES細(xì)胞沒有轉(zhuǎn)入經(jīng)選擇基因，無法控制植入細(xì)胞的命運(yùn)，可能發(fā)生癌變；③ntES細(xì)胞分化成分復(fù)雜，目的細(xì)胞分化成分少，可能出現(xiàn)大量非必須細(xì)胞的分化.

2.2細(xì)胞生物學(xué)通過研究ntES細(xì)胞的體外分化特性，可以識別某些靶基因，對人類新基因的發(fā)現(xiàn)，功能基因的研究，以及基因治療的研究均有重要意義. 通過探討ntES細(xì)胞體外增殖和分化的機(jī)制，了解各種生長和分化因子的作用，為組織再生和修復(fù)的研究提供了新的工具；通過誘導(dǎo)ntES細(xì)胞癌變，可分析腫瘤細(xì)胞發(fā)生的分子機(jī)制. ntES細(xì)胞作為一種得天獨厚的研究材料，對于闡明細(xì)胞增殖、分化、凋亡、遷徙、惡變等機(jī)制有著重要意義. 自發(fā)現(xiàn)ES細(xì)胞以來，人們已經(jīng)利用ES細(xì)胞建立了多種細(xì)胞類型的體外分化系統(tǒng)，體外分化的多種細(xì)胞類型都曾被成功的植入胎鼠或成體鼠，在受體鼠體內(nèi)形成有功能的細(xì)胞群.

2.3發(fā)育生物學(xué)由于哺乳動物在母體內(nèi)受胚胎發(fā)育的個體大小和內(nèi)環(huán)境條件的限制，很難系統(tǒng)地研究其早期的發(fā)育進(jìn)展、細(xì)胞分化及調(diào)控機(jī)制等. 比較動物卵母細(xì)胞質(zhì)對同種或異種細(xì)胞核發(fā)育的影響，在細(xì)胞和分子水平上為研究哺乳動物胚胎早期發(fā)育的調(diào)控機(jī)制提供了良好的材料和方法，也為研究胚胎發(fā)育的影響因素提供了便利條件. 建立在ES細(xì)胞和基因打靶技術(shù)基礎(chǔ)上的復(fù)雜的轉(zhuǎn)基因系，使人們可以建立有效的分析系統(tǒng)，從而在分子水平上研究不同的生物學(xué)問題. 它不僅可以將一些在發(fā)育過程中對動物體非必需或可被替代的特定基因進(jìn)行敲除(gene knockout)，在體內(nèi)進(jìn)行功能缺失研究，而且還可以研究基因在不同發(fā)育時期中的作用. ntES細(xì)胞作為一種體外細(xì)胞系，提供了一個研究處理整體細(xì)胞群的實驗體系. 因此，就有可能人為地產(chǎn)生一些基因突變，如對胚胎致死性基因的研究等，也可利用這些突變的基因來克隆產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠，從而建立基因突變的模型.

3治療性克隆面臨的問題

3.1亟待解決的問題①體細(xì)胞克隆效率與ntES細(xì)胞建系效率普遍較低：核移植胚發(fā)育至囊胚的幾率為19%～25％，與牛、豬的核移植囊胚發(fā)育率相當(dāng)分別約為25％和26％；從克隆囊胚獲得ntES細(xì)胞的效率僅有4%~16％，平均8.2%［11］. ②卵母細(xì)胞來源問題：ntES細(xì)胞用于人治療性克隆，卵母細(xì)胞的需求量是非常大的，目前盡管已有許多措施來改進(jìn)核移植技術(shù)，但仍沒有明顯提高. 要得到一個ntES細(xì)胞系平均需要12 個囊胚，而所需要的卵母細(xì)胞數(shù)就更多了，一個ntES細(xì)胞系平均需要666個. 如果ntES細(xì)胞系用于人類疾病的治療，這樣的代價是非常大的，即使目前報道的最高效率的建系，也是30個卵母細(xì)胞，才能得到一個ntES細(xì)胞系. 另外一種替代策略就是利用非靈長類異種哺乳動物的卵母細(xì)胞，例如兔、山羊等. ③倫理問題：胚胎生物技術(shù)涉及使用早期未著床的胚胎，特別是治療性克隆技術(shù)還將無法避免的使用通過體細(xì)胞克隆獲得的人的早期克隆胚胎. 世界各國尤其是西方國家對此爭論很大［12，13］. 迫于社會公眾與宗教的壓力，大多數(shù)西方國家對治療性克隆技術(shù)應(yīng)用于人類，持反對態(tài)度，不允許國家科研經(jīng)費(fèi)支持治療性克隆的研究. ④臨床應(yīng)用問題：如ES細(xì)胞系可能在培養(yǎng)過程中出現(xiàn)染色體非整倍性問題，ES細(xì)胞定向分化能力及分化細(xì)胞的穩(wěn)定性問題；其次，異種核移植產(chǎn)生的人動物重構(gòu)胚還存在安全性問題：異種重構(gòu)胚在發(fā)育早期含有2種線粒體，以后供核體的線粒體取代了受體的線粒體，但受體卵漿中所帶的異種蛋白，包括細(xì)胞器及mRNA，它們的命運(yùn)如何，是否也像線粒體一樣完全被供核體所取代，還有待進(jìn)一步證明. 再次，在核移植的過程中，可能存在跨種間病毒傳染，例如，人兔核移植胚胎干細(xì)胞，有可能將某些目前未知的兔疾病傳染給人類，就像艾滋病病毒可能是從非洲猩猩而來那樣.

轉(zhuǎn)貼于

3.2建立我國知識產(chǎn)權(quán)的治療性克隆技術(shù)隨著干細(xì)胞技術(shù)和體細(xì)胞核移植技術(shù)的研究進(jìn)展，我國學(xué)者在治療性克隆的技術(shù)方面也處于世界前列. 當(dāng)前，在我國研究和發(fā)展治療性克隆技術(shù)，建立我國知識產(chǎn)權(quán)的治療性克隆的細(xì)胞產(chǎn)品，創(chuàng)建細(xì)胞治療產(chǎn)業(yè)，是一個很好的機(jī)遇. 我國在治療性克隆研究領(lǐng)域的優(yōu)勢：①目前，我國在哺乳動物克隆技術(shù)的研究方面處于國際先進(jìn)水平，相繼成功克隆出了牛、羊等動物. 1991年，西北農(nóng)林科技大學(xué)生物工程研究所在世界上首次獲得山羊胚胎細(xì)胞核移植成功，共得到5只羔羊. 1998年，該研究小組用來自成年雌性山羊的皮膚成纖維細(xì)胞作供體，采用細(xì)胞質(zhì)內(nèi)直接注射的方法將供體細(xì)胞核直接注入去核卵母細(xì)胞內(nèi)，胚胎激活后移植到受體母羊子宮角，獲得了2只體細(xì)胞核移植后代，這是世界上首批成年體細(xì)胞克隆山羊，并獲得了克隆山羊的第4代后裔，目前仍生長健康. ②寬松的人文環(huán)境. 中國公眾有著不同于西方的倫理觀念，對于動物權(quán)利和早期胚胎的擔(dān)心沒有西方國家嚴(yán)重，也基本沒有因為宗教信仰而反對胚胎生物技術(shù)的問題. ③法律和法規(guī)的基本保證. 為保證和促進(jìn)人胚胎干細(xì)胞研究的健康發(fā)展，國家科技部和衛(wèi)生部聯(lián)合下發(fā)了《人胚胎干細(xì)胞研究的倫理指導(dǎo)原則》，使治療性克隆的研究合法化. 但我國明令禁止克隆人和買賣人類胚胎.

然而，中國的優(yōu)勢不能在治療性克隆的研究領(lǐng)域走在國際前列，主要原因是經(jīng)費(fèi)不足和相關(guān)學(xué)者缺乏協(xié)同研究. 應(yīng)用克隆技術(shù)結(jié)合胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化和細(xì)胞治療方法的關(guān)鍵是技術(shù)問題. 我們希望臨床學(xué)者與基礎(chǔ)細(xì)胞生物學(xué)家聯(lián)手合作，借鑒國外的思路，應(yīng)用自愿者的卵母細(xì)胞，建立中國人的ntES培養(yǎng)技術(shù)，為治療性克隆的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ). 我們堅信，中國有可能在這個領(lǐng)域走在世界前沿.

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第6篇

【摘要】 為了觀察了解兒童急性白血病細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子PAX5的表達(dá)特性，采用實時定量RT-PCR方法測定了6個血液腫瘤細(xì)胞株以及6例正常兒童、58例初發(fā)和4例復(fù)發(fā)急性白血病兒童（其中包括39例B-ALL，10例T-ALL和13例AML）骨髓細(xì)胞中PAX5和CD19 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果表明：在Namalwa（B細(xì)胞系）細(xì)胞株中，PAX5和CD19 mRNA相對表達(dá)量分別為2.35%和2.52%；而在T-和髓系細(xì)胞株中幾乎不表達(dá)。在臨床樣本中B-ALL組比T-ALL組和AML組的PAX5 mRNA表達(dá)高（P=0.029和P=0.013）。T-ALL組和AML組的PAX5 mRNA表達(dá)水平均低于正常對照組，而T-ALL組與AML組之間的表達(dá)差異無顯著意義。在B-ALL患兒中，PAX5 mRNA表達(dá)的個體差異很大。此外還發(fā)現(xiàn)，初發(fā)治療前組和復(fù)發(fā)組的B-ALL患兒PAX5 mRNA表達(dá)高于化療完全緩解組（P=0.011和P=0.006）。由于在CD19基因的啟動子上有B細(xì)胞特異性激活蛋白的結(jié)合位點，研究發(fā)現(xiàn)在B-ALL中PAX5表達(dá)水平與同樣用實時定量RT-PCR檢測的CD19表達(dá)水平之間存在明顯的相關(guān)性。結(jié)論：運(yùn)用實時定量RT-PCR方法能快速準(zhǔn)確地在B-ALL的臨床標(biāo)本中檢測和定量PAX5基因的表達(dá)。研究中發(fā)現(xiàn)部分B-ALL中PAX5 mRNA表達(dá)明顯升高，因此它可將其作為進(jìn)一步研究B-ALL發(fā)病機(jī)理的另一個切入點。

【關(guān)鍵詞】 轉(zhuǎn)錄因子

Expression of the Transcription Factor PAX5 in Childhood Acute Leukemic Cells

Abstract

To investigate transcription factor PAX5 expression characteristics in childhood acute leukemic cells，expression levels of PAX5 and CD19 mRNA in 6 hematological tumor cell lines and bone marrow cells of 6 normal children，58 de novo patients and 4 relapse acute leukemic children，including 39 cases of B-ALL，10 cases of T-ALL and 13 cases of AML，were detected by a real-time RT-PCR. The results showed that PAX5 and CD19 mRNA expression levels were 2.35% and 2.52% in Namalwa (B-cell lines) respectively，but almost not detectable in other T- and myeloid cell lines. Among clinical samples，expression of PAX5 mRNA in B-ALL was significantly higher than that in T-ALL and AML(P=0.029 and P=0.013 respectively). PAX5 expression was significantly lower in T-ALL and AML than that in normal controls.The difference of PAX5 mRNA expression levels between T-ALL and AML was not significant. Inpidual difference of PAX5 mRNA expression levels in children with B-ALL was great. Moreover，PAX5 mRNA expressions in de novo

and relapse patients with B-ALL were significantly higher than those in remission (P=0011 and P=0.006 respectively). As binding sites for B-cell specific activator protein have been identified in the promoter regions of CD19，the study found that in B-ALL，there was clear correlation between the expression levels of PAX5 and CD19，which was also studied by real-time RT-PCR. It is concluded that PAX5 transcripts are readily detectable and quantifiable in clinical materials with B-ALL by real-time RT-PCR. The strong PAX5 mRNA expression in some B-ALL can be considered to be particularly interesting for further analysis.

Key words transcription factor；PAX5；CD19；acute leukemic cell；real-time RT-PCR

PAX5基因是成對區(qū)PAX基因家族的成員，它編碼的核反式作用因子——B細(xì)胞特異性激活蛋白（B-cell specific activator protein，BSAP）在發(fā)育的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、成人和B淋巴細(xì)胞中表達(dá)［1］。在B細(xì)胞發(fā)育過程中，PAX5基因的轉(zhuǎn)錄起始于Pro-B（Pre-B1）期，表達(dá)于Pre-B和成熟B細(xì)胞中，但在漿細(xì)胞中不表達(dá)［1，2］。BSAP通過與多種B細(xì)胞特異性基因（如CD19，VpreB，RAG2，mb-1）啟動子或增強(qiáng)子上的BSAP結(jié)合位點結(jié)合，對這些基因的表達(dá)起著調(diào)控作用，因而BSAP在B細(xì)胞定向分化、發(fā)育、增殖、同型轉(zhuǎn)換、免疫球蛋白分泌和終末分化階段中發(fā)揮了重要的作用［1］。近年來研究表明，PAX5基因在成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、成人惡性膠質(zhì)瘤、淋巴瘤和人膀胱移行細(xì)胞癌中表達(dá)失調(diào)，并且與惡性分化程度相關(guān)［3］。在血液腫瘤中，以往有關(guān)PAX5的研究主要局限于在淋巴瘤中的改變［4-6］。有關(guān)PAX5在急性白血?。ㄓ绕涫羌毙訠淋巴細(xì)胞性白血病）中較為詳盡的研究迄今為止文獻(xiàn)報道很少［5，6］。本研究在mRNA水平運(yùn)用實時定量RT-PCR檢測血液腫瘤細(xì)胞株、兒童急性白血病細(xì)胞及正常兒童骨髓細(xì)胞中PAX5 mRNA的表達(dá)水平，從中了解PAX5在兒童急性白血病中的表達(dá)特性，為進(jìn)一步明確其在急性白血病發(fā)生中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，同時也為利用PAX5基因表達(dá)產(chǎn)物作為潛在腫瘤標(biāo)志和基因治療靶位的應(yīng)用方面提供依據(jù)。

材料和方法

血液腫瘤細(xì)胞株及培養(yǎng)

6個血液腫瘤細(xì)胞株：Namalwa、SUP-M2、K-562、NB4、HL-60、Jurkat用含2 mmol/L谷氨酰胺和10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液在37℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

臨床病例來源

2003年2月至2004年2月新華醫(yī)院、上海兒童醫(yī)學(xué)中心收治的初發(fā)和復(fù)發(fā)兒童急性白血病患者62例，其中初發(fā)病例58例，復(fù)發(fā)病例4例；男45例，女17例；年齡4個月-15歲，中位年齡6歲。所有患兒均采用MIC（即細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫表型、細(xì)胞遺傳學(xué)及相關(guān)的分子生物學(xué)）分型診斷。按FAB分型，ALL 49例（包括L1 15例，L2 21例，L3 7例，未分亞型者6例）；AML 13例（包括M1 1例，M2a 3例，M2b 1例，M3 2例，M4 2例，M5 3例，M7 1例）。在ALL中，按免疫表型可分為T系-ALL 10例和B系-ALL 39例；39例B系-ALL（CD19+）還可進(jìn)一步分成4個亞型，分別是： Pro B（CD10-/cytoplasmic μ〖cμ］-）1例，CALL（即Common-B-ALL，CD10+/cμ-）26例，Pre B（CD10+ or -/cμ+）11例和B Cell（即mature-B-Cell，SIg+）1例。另收集13例B系-ALL患兒誘導(dǎo)緩解治療結(jié)束時微小殘留?。∕RD）監(jiān)測

采集上述正常對照兒童及白血病患兒的骨髓或外周血標(biāo)本2-3 ml（肝素抗凝），用淋巴細(xì)胞分離液室溫300×g離心30分鐘，分離單個核細(xì)胞，再用PBS洗滌2次，取約5×106個細(xì)胞加TRIZOL試劑1 ml，混勻后，-80℃保存，待提取RNA之用。初發(fā)和復(fù)發(fā)病例標(biāo)本中白血病細(xì)胞的百分比>80%，必要時B系-ALL標(biāo)本可通過CD19單克隆抗體免疫磁珠分選法富集白血病細(xì)胞（參見Immunotech公司免疫磁珠分選說明書）。

RNA提取和cDNA合成

總RNA提取參照TRIZOL試劑說明書。用紫外分光光度計測RNA濃度（RNA 濃度=A260×40 μg/ml×1/光徑×稀釋倍數(shù)）及純度（A260/A280比值在1.8-2.0），再用2%瓊脂糖凝膠電泳確定RNA質(zhì)量，而后RNA可儲存于-80℃?zhèn)溆?。cDNA的合成根據(jù)TaqMan反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，把0.2 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成為單鏈cDNA。反應(yīng)體系10 μl，包括10×TaqMan RT緩沖液1 μl，25 mmol/L MgCl2 2.2 μl，dNTPs mixture（2.5 mmol/L each dNTP）2.0 μl，50 μmol/L隨機(jī)引物0.5 μl，RNase抑制劑（20 U/μl）0.2 μl，MultiScribe逆轉(zhuǎn)錄酶（50 U/μl） 0.25 μl，以及已溶解在3.85 μl無RNase水中的0.2 μg RNA。上述混合物孵育在25℃ 10分鐘，48℃ 30分鐘和95℃ 5分鐘。所獲得的cDNA可儲存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

實時PCR

實時定量PCR運(yùn)用TaqMan Universal PCR Master Mix試劑盒在ABI Prism 7000實時熒光定量PCR儀上檢測。PAX5、CD19和GAPDH的引物和探針采用TaqMan Assays-on-Demand基因表達(dá)產(chǎn)品，其MGB探針以FAM染料作為熒光標(biāo)記。實時PCR反應(yīng)體積25 μl各含TaqMan Universal PCR Master Mix（2×）12.5 μl，20×Assay-on-Demand Gene Expression Assay Mix 1.25 μl以及25 ng cDNA模板。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)熱50℃ 2 分鐘（激活uracil-N-glycosylase），95℃ 10分鐘（滅活UNG酶，同時激活A(yù)mpliTaq Gold DNA Polymerase），緊接著40個循環(huán)的95℃ 15秒（變性）和60℃ 1分鐘（退火和延伸）。本研究同時把Namalwa細(xì)胞株RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA進(jìn)行系列稀釋作為實時PCR擴(kuò)增模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以證明靶基因PAX5、CD19和內(nèi)源控制物GAPDH的擴(kuò)增效率基本相同。由于所有的PCR反應(yīng)具有基本一致的擴(kuò)增效率，因此就可以用比較Ct法的相對定量策略，即每個樣本PAX5、CD19的相對mRNA表達(dá)水平能直接用樣本各自的內(nèi)源控制物GAPDH表達(dá)來標(biāo)準(zhǔn)化加入的初始RNA量。簡單地說，每個樣本中靶基因PAX5、CD19的相對mRNA表達(dá)水平可以用以下公式計算：相對mRNA表達(dá)=2-Ct×100%，式中Ct值=靶基因Ct值-GAPDH Ct值。

統(tǒng)計學(xué)處理

用SAS 6.12統(tǒng)計軟件包和Sigma Plot 2001，Version 7.101軟件處理數(shù)據(jù)并繪制統(tǒng)計圖，PAX5 mRNA相對表達(dá)量用x±SD（%）表示，采用t檢驗和線性相關(guān)與回歸進(jìn)行分析。P≤0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義（雙側(cè)檢驗）。

結(jié) 果

血液腫瘤細(xì)胞株的PAX5和CD19 mRNA表達(dá)

本研究運(yùn)用實時RT-PCR比較Ct相對定量法，檢測了6個血液腫瘤細(xì)胞株中PAX5和CD19的mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)人成熟B細(xì)胞性淋巴瘤細(xì)胞株Namalwa的PAX5和CD19 mRNA相對表達(dá)量分別為2.35%和2.52%；而T細(xì)胞株（SUP-M2和Jurkat）的PAX5 mRNA表達(dá)極微量，分別為0.0033%和0.0018%，且未檢測到其相應(yīng)的CD19 mRNA表達(dá)；髓系細(xì)胞株（K-562、NB4和HL-60）PAX5 mRNA表達(dá)均為陰性。

急性白血病兒童與正常對照兒童的PAX5 mRNA表達(dá)

本研究運(yùn)用實時RT-PCR檢測了臨床初診和復(fù)發(fā)的39例B-ALL、10例T-ALL和13例AML骨髓白血病細(xì)胞PAX5 mRNA的相對表達(dá)量，同時也檢測了6例非血液系統(tǒng)疾病兒童骨髓和8例健康兒童外周血單個核細(xì)胞PAX5 mRNA的相對表達(dá)量作正常對照。圖1顯示了上述不同類型的急性白血病和正常對照中PAX5 mRNA相對表達(dá)量的分布，從中可見B-ALL的PAX5 mRNA相對表達(dá)量范圍變化很大，從（0.12-61.13）%不等。表1列出了急性白血病兒童與正常對照兒童平均PAX5 mRNA表達(dá)量的比較。統(tǒng)計表明： B-ALL組的平均PAX5 mRNA表達(dá)量比T-ALL組和AML組高（P0.05）。T-ALL組與AML組之間的平均PAX5 mRNA表達(dá)量差異也無顯著意義（P>0.05），但其分別與正常對照BM和PB組的平均表達(dá)量差異有非常顯著意義（P

B-ALL兒童的PAX5 mRNA表達(dá)

初發(fā)和復(fù)發(fā)B-ALL患兒骨髓白血病細(xì)胞的PAX5 mRNA表達(dá)范圍變化很大，從0.12%到61.13%，平均表達(dá)（9.65±13.21）%，不存在性別差異（男女患兒平均表達(dá)分別為（8.53±12.13）%、（13.41±16.58）%，P=0.337）。本研究僅檢測了1例10歲患兒的平均PAX5 mRNA表達(dá)為（5.22±6.34）%，兩組之間差異無顯著意義（P=0.284）。按照FAB分型，L1、L2和L3 3組之間的PAX5 mRNA表達(dá)經(jīng)兩兩比較差異均無顯著性意義（P>0.05）。

比較不同化療階段B-ALL患兒PAX5 mRNA表達(dá)發(fā)現(xiàn)：初診化療前組患兒與復(fù)發(fā)組患兒的平均PAX5 mRNA表達(dá)差異無顯著意義（P>0.05），而化療緩解（MRD

本研究在運(yùn)用實時RT-PCR檢測臨床病例和正常對照的樣本中PAX5 mRNA相對表達(dá)量的同時，還檢測了樣本中CD19 mRNA相對表達(dá)量。通過統(tǒng)計分析39例B-ALL樣本中PAX5 mRNA與CD19 mRNA相對表達(dá)量之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)：在mRNA水平上PAX5的表達(dá)與CD19的表達(dá)之間存在明顯的相關(guān)關(guān)系（r=0.516，P=0.0008）（圖2）。

討 論

兒童急性白血?。ㄒ约毙訠淋巴細(xì)胞性白血病為主）是嚴(yán)重危害兒童生命的惡性腫瘤。隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)的進(jìn)步，當(dāng)前以化療為主要手段的綜合治療已使大多數(shù)急性白血病患兒經(jīng)治療后可獲得緩解，但最終仍有部分患兒復(fù)發(fā)。對于白血病的確切發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，因此從細(xì)胞發(fā)育、增殖、分化等方面多角度深入研究兒童急性白血病發(fā)生發(fā)展中的表達(dá)特性，從中逐步明確其發(fā)生機(jī)理，將為白血病的治療提供新的思路并將提高白血病的治愈率及長期無病生存率。

在淋巴造血系統(tǒng)中，PAX5/BSAP被認(rèn)為是B細(xì)胞特異性的標(biāo)志。目前臨床上對于PAX5/BSAP的研究主要集中于運(yùn)用免疫組織化學(xué)檢測正常淋巴組織細(xì)胞和血液腫瘤（主要是淋巴瘤）組織細(xì)胞中BSAP的表達(dá)［4-6］。Krenacs等［4］和Torlakovic等［5］對較大數(shù)量的多種亞型淋巴組織標(biāo)本中BSAP表達(dá)的研究顯示，BSAP僅表達(dá)于正常和腫瘤的B細(xì)胞中，且在不同的B細(xì)胞亞類和B細(xì)胞非何杰金氏淋巴瘤亞型中PAX5表達(dá)的水平各不相同，而在T細(xì)胞和T細(xì)胞性淋巴瘤細(xì)胞中表達(dá)為陰性。然而新近同樣的研究，Zhang等［6］的報告卻顯示PAX5在1個T細(xì)胞性淋巴瘤細(xì)胞中表達(dá)，并且在T-ALL和AML中也有50%表達(dá)PAX5。此外，Hamada等［7］報道，運(yùn)用RT-PCR能快速地在不同種類B細(xì)胞性腫瘤的臨床標(biāo)本中檢測到PAX5轉(zhuǎn)錄。

本研究首先運(yùn)用了實時RT-PCR比較Ct法的定量策略來檢測血液腫瘤細(xì)胞株中PAX5和CD19的mRNA相對表達(dá)量，在6個血液腫瘤細(xì)胞株中Namalwa（B細(xì)胞系）的PAX5和CD19 mRNA相對表達(dá)量分別為2.35%和2.52%，而T系和髓系細(xì)胞株幾乎不表達(dá)，這與Hamada等［7］的研究結(jié)果相近。

本研究還運(yùn)用實時RT-PCR來測定臨床初診和復(fù)發(fā)的兒童急性白血病骨髓細(xì)胞中PAX5 mRNA的表達(dá)，并以正常BM和PB的單個核細(xì)胞作對照。研究發(fā)現(xiàn)：在不同白血病和正常對照中平均PAX5 mRNA表達(dá)高低依次順序為B-ALL組>Normal BM組>Normal PB組>T-ALL組>AML組。由此可見，在兒童急性白血病中，PAX5主要在B-ALL中表達(dá)，而T-ALL和AML中表達(dá)均極低；研究中發(fā)現(xiàn)部分B-ALL中PAX5 mRNA表達(dá)明顯升高，因此可將其作為進(jìn)一步研究B-ALL發(fā)病機(jī)理的另一個切入點。

此外，不同化療階段B-ALL的PAX5 mRNA表達(dá)的分析發(fā)現(xiàn)：初診化療前組和復(fù)發(fā)組的平均PAX5 mRNA表達(dá)比化療緩解組的表達(dá)高。因此，對于ALL兒童最好應(yīng)在初診化療前即測定PAX5 mRNA表達(dá)，其后作動態(tài)觀察，這樣可以評估治療反應(yīng)，利于及時調(diào)整化療方案。

在許多B細(xì)胞特異性基因的啟動子上目前已發(fā)現(xiàn)多種BSAP的結(jié)合位點［8］，其中包括CD19基因啟動子上的BSAP結(jié)合位點［9］，通過此位點BSAP對CD19表達(dá)起調(diào)節(jié)作用。CD19是B細(xì)胞表面信號傳導(dǎo)系統(tǒng)的一個主要成分，它的活化啟動多種細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑［10］。本研究在用實時RT-PCR研究B-ALL中PAX5 mRNA表達(dá)的同時，也檢測了相應(yīng)的CD19 mRNA表達(dá)，經(jīng)統(tǒng)計分析兩者之間的表達(dá)存在明顯的相關(guān)性，與此前的有關(guān)研究報道［6，7］不甚一致，其可能的原因是： ①研究對象不同，此前的報道主要是淋巴瘤，且研究標(biāo)本量少；本研究對象則為B-ALL，標(biāo)本量相對較多；②研究方法不同，此前的報道運(yùn)用的是Northern blot，傳統(tǒng)PCR和流式細(xì)胞術(shù)；本研究運(yùn)用實時RT-PCR。鑒于在B-ALL中PAX5與CD19 mRNA表達(dá)之間存在的明顯相關(guān)性，可以認(rèn)為，在B-ALL中PAX5通過調(diào)控其目標(biāo)基因CD19表達(dá)來影響細(xì)胞內(nèi)多種信號傳導(dǎo)途徑，進(jìn)一步可能影響腫瘤的發(fā)展。

由于目前未見有關(guān)詳細(xì)研究白血病中PAX5 mRNA表達(dá)特性的文獻(xiàn)報道，因此沒有與本研究結(jié)果可以相比較的相關(guān)資料可資參照分析。也就是說，本研究可能是首次較為詳盡地報道運(yùn)用實時RT-PCR評估急性白血病細(xì)胞中PAX5 mRNA的表達(dá)。至于在B-ALL中PAX5表達(dá)的更加確切的規(guī)律和作用，還有待于對更多臨床樣本進(jìn)行較為長期的觀察研究。

參考文獻(xiàn)

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6Zhang X，Lin Z，Kim I. Pax5 expression in non-Hodgkin’s lymphomas and acute leukemias. J Korean Med Sci，2003；18:804-808

7Hamada T，Yonetani N，Ueda C，et al.Expression of the PAX5/BSAP transcription factor in haematological tumour cells and further molecular characterization of the t(9；14)(p13；q32) translocation in B-cell non-Hodgkin’s lymphoma. Br J Haematol，1998；102:691-700

8Neurath MF，Stuber ER，Strober W. BSAP: a key regulator of B-cell development and differentiation. Immunol Today，1995；16:564-569

第7篇

【關(guān)鍵詞】 胃腫瘤；抑癌基因；Runx3

Runx3（PEBP2αC/CBF A3/AML2）基因是一個腫瘤抑制基因，其功能缺失與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。自2002年日本學(xué)者Li等［1］首先報道Runx3有調(diào)節(jié)胃上皮細(xì)胞的增生與凋亡平衡的作用以來，Runx3與胃癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)研究已成為胃癌研究領(lǐng)域的熱點。現(xiàn)對Runx3與胃癌的研究現(xiàn)狀做一綜述。

1 Runx3基因、蛋白結(jié)構(gòu)及其功能

Runx3來自Runt結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子（Runt domain transcription factors），是轉(zhuǎn)錄因子Runx家族成員之一，Runt區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子也稱PEBP2/CBF（polyomavirus enhancer-core binding protein 2/core binding factor），是TGF-β超家族信號重要的靶目標(biāo)，在哺乳動物生長過程中扮演重要角色。該基因家族在哺乳動物有3個成員Runx1、Runx2、Runx3，它們的產(chǎn)物都是由α和β亞單位構(gòu)成的異二聚體［2］，具有不同生物學(xué)功能，Runx1與造血功能有關(guān)，Runx2是重要的骨生成調(diào)節(jié)因子，Runx3對脊神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)發(fā)育及胃黏膜上皮細(xì)胞的增生調(diào)控和T細(xì)胞的分化起重要作用［1，3］。

Runx3（Runt related transcription factor 3 gene）基因位于人染色體的1p36.1，基因全長約67 kb，含有P1和P2 兩個啟動子，6個外顯子和1 290 bp的開放閱讀框，內(nèi)含子1跨越了整條基因全長的一半（35kb）。兩個啟動子區(qū)域均含數(shù)個分離的轉(zhuǎn)錄起始點，其中Runx3 mRNA主要來自于P2啟動子的轉(zhuǎn)錄［3］。兩個啟動子的GC含量不同，P2啟動子GC含量高（64％）。在外顯子2 相當(dāng)于啟動子P2 的位置和外顯子6 的起始部位有兩個大CpG島［4］。

人類Runx3蛋白是α、β兩個亞單位構(gòu)成的異二聚體，包含415個氨基酸殘基，α亞單位含有一個 RD（Runt domain）保守域，RD位于Runx蛋白的氨基酸末端，由128個氨基酸組成，介導(dǎo)Runx蛋白與DNA結(jié)合以及蛋白質(zhì)之間的相互作用［5，6］。α亞單位介導(dǎo)RD與靶DNA結(jié)合，β亞單能增強(qiáng)RD與靶DNA的結(jié)合力［7］。

Runx蛋白的羧基端富含脯氨酸和絲氨酸，對基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控起重要作用［2，7］。

2 Runx3與胃癌的相關(guān)研究及其抑癌機(jī)制

2.1 Runx3與胃黏膜的關(guān)系 Li等［1］研究發(fā)現(xiàn)敲除Runx3（Runx3-/-）的小鼠胃黏膜明顯增厚，Runx3-/-小鼠培養(yǎng)細(xì)胞對TGF-β誘導(dǎo)的生長抑制和凋亡作用不敏感，且Runx3-/-小鼠胃組織中半胱天冬酶3（caspase3）無活性［1］。Fukamachi等［8］研究發(fā)現(xiàn)Runx3 缺失時胃黏膜細(xì)胞處于低分化狀態(tài)。這些觀察表明Runx3是胃黏膜上皮主要生長調(diào)控因子，是胃上皮細(xì)胞中重要的致凋亡因素。

2.2 胃癌中Runx3表達(dá)情況 研究發(fā)現(xiàn)，胃癌中Runx3的表達(dá)明顯下調(diào)或缺失。Li等［1］應(yīng)用RT-PCR、Southern blot和原位雜交方法對15株胃癌細(xì)胞系和46例胃癌組織標(biāo)本的Runx3 mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)47%的胃癌細(xì)胞系中Runx3無或低表達(dá);60.9%的胃癌組織中Runx3無表達(dá)或低表達(dá)，Runx3的表達(dá)率與胃癌臨床分期呈負(fù)相關(guān)。所以認(rèn)為Runx3 基因與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有著極其密切的關(guān)系，并且隨著胃癌分期的增高表達(dá)進(jìn)一步降低。Osaki等［9］應(yīng)用Western印跡法分析了6株胃癌細(xì)胞系Runx3蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，結(jié)果50%的細(xì)胞系Runx3表達(dá)陽性，與Li等報道的結(jié)果基本一致;此外，還通過免疫組化法揭示83例正常胃黏膜組織均有Runx3表達(dá)，而對應(yīng)的腸上皮化生組織和癌組織中均無Runx3 表達(dá)［9］。

2.3 Runx3與胃癌的相關(guān)性 Li等［1］報道Runx3-/-、p53-/-小鼠胃黏膜培養(yǎng)細(xì)胞能建立裸鼠種植腫瘤（腺癌），而Runx3+/+、p53-/-小鼠胃黏膜上皮培養(yǎng)細(xì)胞則不能，這表明Runx3功能缺失可能誘導(dǎo)了胃癌的發(fā)生。Guo等［10］以胃癌細(xì)胞系（Runx3-/-）作為感受態(tài)細(xì)胞，將外源性Runx3基因分別轉(zhuǎn)染克隆體，結(jié)果顯示，Runx3高表達(dá)克隆組細(xì)胞生長抑制最明顯，Runx3低表達(dá)組次之，說明Runx3的表達(dá)量與胃癌細(xì)胞的生長曲線成負(fù)相關(guān)。Sakakura等［11］研究發(fā)現(xiàn)胃癌原發(fā)灶和腹膜轉(zhuǎn)移灶Runx3 mRNA表達(dá)較正常胃黏膜明顯下調(diào)，尤以腹膜轉(zhuǎn)移灶下降程度最著。將轉(zhuǎn)染外源性Runx3的胃癌細(xì)胞系注入裸鼠腹腔，結(jié)果轉(zhuǎn)染組腹腔內(nèi)極少有種植結(jié)節(jié)，而無轉(zhuǎn)染對照組動物腹腔內(nèi)有大量的、明顯的種植結(jié)節(jié)形成。因此認(rèn)為Runx3基因的失表達(dá)與胃癌的腹膜轉(zhuǎn)移發(fā)生有關(guān)。Wei等［12］揭示胃癌組織中Runx3表達(dá)水平與患者的生存期密切相關(guān)。Peng 等［13］通過對120例胃癌組織中Runx3表達(dá)與血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達(dá)的相關(guān)分析，揭示Runx3的轉(zhuǎn)錄可能與胃癌組織中VEGF的表達(dá)下調(diào)有關(guān)。因此Runx3基因沉默可能會加速胃癌的生長和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

2.4 Runx3抑癌機(jī)制 Runt區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子與TGF-β超家族成員共同介導(dǎo)一些重要的生物學(xué)效應(yīng)。TGF-β與其跨膜受體Ⅰ和Ⅱ（TβRⅠ和TβRⅡ）結(jié)合，產(chǎn)生受體異四聚體復(fù)合物（TβRC），從而發(fā)揮細(xì)胞內(nèi)生物效應(yīng)［14］，此過程中Smad蛋白起重要的作用。TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的配體、受體和胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Smad蛋白共同組成一個抑制腫瘤信號的通路。通路異常即可引起信號紊亂，促進(jìn)多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［15］。Runx3蛋白是TGF-β信號通路下游的一個轉(zhuǎn)錄因子，Runx蛋白與DNA結(jié)合，在TGF-β/BMP（bone morphogenetic protein）信號傳導(dǎo)中起重要作用。只有在Runx蛋白的參與下，Smad復(fù)合物才能從細(xì)胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)入核內(nèi)的功能靶點，與Runx蛋白共同轉(zhuǎn)錄激活靶基因，從而對細(xì)胞的分化、周期調(diào)控、凋亡和惡性轉(zhuǎn)化起作用［16］。當(dāng)Runx基因表達(dá)受抑制時，影響TGF-β信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生。

Chi等［17］研究顯示Runx3是p21基因的下游調(diào)控子，p21在細(xì)胞生長周期中有重要作用，其通過抑制周期素依賴性蛋白激酶（cyclin-dependent Kinase，CDK）表達(dá)而使細(xì)胞周期停滯于G1期。p21啟動子包括5個Runx結(jié)合位點，即3個完全匹配的a、b、c位點和2個部分匹配的d、e位點，當(dāng)Runx結(jié)合域突變時，p21啟動子的活性明顯降低，而Runx3和Smad3協(xié)同表達(dá)時p21啟動子被激活，從而使細(xì)胞對TGF-β反應(yīng)增強(qiáng)。Runx3的抑癌活性與其誘導(dǎo)p21表達(dá)的能力相關(guān)，p53也是通過調(diào)控p21表達(dá)活性來調(diào)節(jié)細(xì)胞生長周期，故兩者作用機(jī)制類似，但作用的信號通路不同。最近有研究顯示恢復(fù)Runx3表達(dá)可導(dǎo)致cyclin D表達(dá)下調(diào)，相反 p27和caspase3、7和8則表達(dá)上調(diào)。這可能是Runx3誘導(dǎo)凋亡的潛在機(jī)制［14］。

因此，Runx3抑癌機(jī)制主要通過TGF-β信號通路協(xié)同Smad蛋白激活p21調(diào)節(jié)細(xì)胞生長周期，并通過下調(diào)cyclin D表達(dá)和上調(diào)p27和caspase3、7和8的表達(dá)而誘導(dǎo)凋亡。

3 胃癌中Runx3基因表達(dá)降低或缺失的機(jī)制

3.1 Runx3基因突變與表達(dá) 基因突變是抑癌基因沉默的主要機(jī)制之一，然而文獻(xiàn)報道突變不是Runx3表達(dá)下調(diào)的主要機(jī)制［1，12，18］。

3.2 Runx3基因雜合性缺失與表達(dá) Li等［1］應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)（FISH）對15個胃癌細(xì)胞系和46例胃癌組織Runx3DNA倍體進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)20%的胃癌細(xì)胞系和30%的胃癌組織中的Runx3為異倍體。并采用RT-PCR方法和原位雜交方法分別對這些發(fā)生雜合缺失胃癌細(xì)胞系和胃癌組織標(biāo)本進(jìn)行Runx3 mRNA表達(dá)的檢測，發(fā)現(xiàn)除1例胃癌組織可以檢測到Runx3 mRNA表達(dá)外，其余均無Runx3 mRNA表達(dá)。22例Ⅰ期胃癌中有3例Runx3存在雜合缺失，2例Ⅱ期胃癌沒有發(fā)現(xiàn)雜合缺失，14例Ⅲ期胃癌中3例Runx3 存在雜合缺失，8例Ⅳ期胃癌中Runx3全都發(fā)生雜合缺失變化，說明Runx3的雜合缺失是胃癌中Runx3失活的原因之一，并且Runx3的雜合缺失和胃癌的分期有關(guān)。

3.3 Runx3甲基化是胃癌中Runx3表達(dá)下調(diào)的主要原因 啟動子異常甲基化在基因表達(dá)調(diào)控、DNA修復(fù)、基因穩(wěn)定及基因抑制方面起重要作用。Runx3啟動子P2區(qū)域有一個典型CpG島，理論上說明DNA甲基化可調(diào)控P2的轉(zhuǎn)錄。

Li等［1］揭示Runx3低表達(dá)或失表達(dá)都與Runx3啟動子P2區(qū)域CpG島過甲基化有關(guān)。Guo等［10］用N2甲基2N2亞硝基脲誘導(dǎo)鼠胃癌，從中建立4株胃癌細(xì)胞系，結(jié)果僅一株細(xì)胞系有微量的Runx3 mRNA表達(dá)，其他3株細(xì)胞系均無Runx3 mRNA表達(dá)，這3株Runx3基因沉默細(xì)胞系在Runx3啟動子區(qū)域亦存在明顯甲基化，所有細(xì)胞系經(jīng)過DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑52氮唑22脫氧胞苷（deoxycytidine，AZA）、組蛋白去乙酰酶抑制劑曲古抑菌素（trichostatin，TSA）共同處理后均恢復(fù)了Runx3表達(dá)。Waki等［19］檢測了10株胃癌細(xì)胞系、93例胃癌組織及相應(yīng)正常胃黏膜組織Runx3 基因啟動子甲基化狀態(tài)，結(jié)果7株胃癌細(xì)胞系、42例胃癌組織和7例正常胃黏膜組織存在甲基化。此外，對19例尸檢的正常胃黏膜組織Runx3甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測，其中3例存在甲基化，但年齡均≥77歲，提示除高齡患者外Runx3甲基化幾乎是癌特異性的。Kim等［20］對75例胃癌和各種胃癌前期病變組織（胃腺瘤77例、慢性胃炎伴腸上皮化生32例和慢性胃炎不伴腸上皮化生99例）Runx3甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在胃癌組織中Runx3甲基化發(fā)生率為64%，而在各種胃癌前期病變組織中也存在不同程度的Runx3甲基化，其中胃腺瘤27.3%、慢性胃炎伴腸上皮化生28.1%和慢性胃炎不伴腸上皮化生8.1%。而在有腹膜轉(zhuǎn)移的胃癌標(biāo)本100%發(fā)現(xiàn)Runx3甲基化［11］。因此認(rèn)為Runx3甲基化發(fā)生隨癌前期病變向癌的方向發(fā)展而增加，從原位癌到進(jìn)展期胃癌Runx3甲基化率隨之升高，說明Runx3甲基化從胃癌的發(fā)生到胃癌的發(fā)展都有很重要的意義。Homma等［21］發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)胃癌細(xì)胞系（90%）、胃癌組織（96%）和配對的正常胃黏膜組織（96%）均存在Runx3基因5′端CpG島的甲基化，而在被視為導(dǎo)致基因沉默的關(guān)鍵部位——轉(zhuǎn)錄起始點附近區(qū)域的甲基化發(fā)生率較低，分別為40%、53%和11%。因此認(rèn)為，Runx3 基因高甲基化起初發(fā)生在5′端CpG島，進(jìn)而向轉(zhuǎn)錄起始點區(qū)域擴(kuò)展，最終導(dǎo)致Runx3 mRNA失表達(dá)，Runx3基因CpG島多區(qū)域甲基化狀態(tài)檢測對胃癌的診斷及風(fēng)險評估具有重要意義。

4 小結(jié)

Runx3作為一個新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，在調(diào)控細(xì)胞生長、發(fā)育、凋亡和以細(xì)胞的信號傳導(dǎo)及其他生物學(xué)效應(yīng)方面有著重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。其啟動子P2區(qū)域CpG島的過甲基化和雜合缺失是Runx3基因沉默的主要機(jī)制。Runx3的轉(zhuǎn)錄失活或表達(dá)下調(diào)可致胃黏膜上皮細(xì)胞的過度增生和分化異常，進(jìn)而參與胃癌的發(fā)生和發(fā)展過程。Runx3有望成為一個惡性腫瘤，特別是胃癌發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)標(biāo)記物和腫瘤基因治療的靶點（如Runx3基因的導(dǎo)入、逆轉(zhuǎn)甲基化治療等），有可能為胃癌等惡性腫瘤的診療提供新的策略和方案。

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第8篇

關(guān)于椎間盤源性腰痛的概念

所謂“椎間盤源性腰痛”從廣義來上講，是指與腰椎間盤退變有關(guān)的腰痛癥狀，當(dāng)包括椎間盤內(nèi)紊亂，椎間盤退行性病以及腰椎不穩(wěn)。1997年Bridwell確定椎間盤源性下腰痛的概念為［1］：椎間盤內(nèi)各種疾病(如退變，終板損傷等)刺激椎間盤內(nèi)疼痛感受器所引起的功能喪失的腰痛，不伴根性癥狀，無神經(jīng)或節(jié)段過度活動的影像學(xué)證據(jù)。目前這個概念被大多數(shù)學(xué)者所接受。

椎間盤源性腰痛的發(fā)病機(jī)制

髓核和纖維環(huán)的破裂：椎間盤纖維環(huán)破裂是椎間盤源性下腰痛的重要原因，在無神經(jīng)根機(jī)械性壓迫的下腰痛患者中，約40%與椎間盤纖維環(huán)破裂有關(guān)。Osti等對27例脊柱尸檢標(biāo)本(平均年齡31.5歲)中的135個腰椎間盤進(jìn)行分析研究［2］，將纖維環(huán)損傷分為外周型、環(huán)型和輻射型，髓核則分為正常、中度退變和嚴(yán)重退變。對中老年患者，椎間盤纖維環(huán)破裂的最常見病理基礎(chǔ)是髓核變性致纖維環(huán)應(yīng)力分布失衡，進(jìn)而導(dǎo)致后部纖維環(huán)破裂，而病變椎間盤內(nèi)高含量的炎性介質(zhì)刺激竇椎神經(jīng)末端的傷害感受器可導(dǎo)致劇烈疼痛。但對于年輕的患者，特別是有劇烈運(yùn)動史時，外周纖維環(huán)的物理損傷可能是導(dǎo)致疼痛的原因之一。

腰椎間盤的神經(jīng)分布及發(fā)病機(jī)制：IDD發(fā)生與腰椎間盤神經(jīng)分布相關(guān)密切。腰椎間盤在纖維環(huán)外1/3處存在豐富的神經(jīng)分布，正常情況下纖維環(huán)內(nèi)1/3和髓核無神經(jīng)分布。纖維環(huán)前外側(cè)由灰交通支支配，后外側(cè)主要由竇椎神經(jīng)分布。石作為等研究認(rèn)為部分椎間盤源性腰痛也具有牽涉痛的性質(zhì)［3］，其理由為腰椎間盤后部纖維環(huán)及后縱韌帶受脊神經(jīng)和交感神經(jīng)的雙重支配，交感神經(jīng)可傳遞疼痛，脊神經(jīng)節(jié)多極神經(jīng)元的存在且能夠傳遞疼痛。

椎間盤內(nèi)化學(xué)物質(zhì)的刺激：炎癥介質(zhì)也與椎間盤源性疼痛的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)退變的人椎間盤組織可自動分泌大量的促炎癥反應(yīng)介質(zhì)，使局部出現(xiàn)自身免疫炎癥反應(yīng)。

椎間盤內(nèi)機(jī)械壓力的改變：正常椎間盤在生理負(fù)重下不會刺激外部纖維環(huán)上的傷害感受神經(jīng)末梢。隨著椎間盤的退化，髓核和軟骨終板變性，纖維環(huán)的松弛或破裂可導(dǎo)致椎體間不穩(wěn)，造成椎間盤內(nèi)壓力的分布不均衡，并導(dǎo)致椎間盤出現(xiàn)異?；顒?，這些異?；顒訉w維環(huán)的后1/3和相鄰的后縱韌帶中帶有大量來自竇椎神經(jīng)的感覺神經(jīng)末梢產(chǎn)生機(jī)械刺激而引起疼痛。

硬膜外炎癥及化學(xué)性神經(jīng)根炎：由纖維環(huán)破裂導(dǎo)致的硬膜外炎癥也可能導(dǎo)致疼痛的產(chǎn)生，Saifuddin等研究伴隨纖維環(huán)破裂的硬膜外炎癥患者［4］，在8例患者M(jìn)RI的T2加權(quán)像發(fā)現(xiàn)12個破裂的纖維環(huán)，而炎性改變總伴隨有纖維環(huán)的破裂。其中4例患者炎性區(qū)域直接包括神經(jīng)根。這些結(jié)果表明，由纖維環(huán)破裂處的炎性化學(xué)性神經(jīng)根病可能是纖維環(huán)撕裂引起疼痛的重要原因。

椎間盤源性腰痛的診斷研究

椎間盤源性腰痛臨床表現(xiàn)常為L4/L5/S1棘間、髂后、臀部、腹股溝、股前、股后、大轉(zhuǎn)子等處的自發(fā)脹痛?；颊叱３Ｐ枰址龃笸炔拍茏谝巫由匣驈囊巫由险酒?。雖然椎間盤源性腰痛可以伴有腿痛，但是，腿痛通常沒有明確的概念，常常難以言表，多主訴為臀部或下肢沉重感或抽筋，而且疼痛區(qū)域缺乏沿神經(jīng)分布的特點，神經(jīng)系統(tǒng)檢查正常，沒有皮膚過敏或感覺缺失。

在影像學(xué)診斷方面，普通X線攝片和CT表現(xiàn)基本正常。MRI對于椎間盤源性疼痛的診斷有重要的意義。椎間盤造影術(shù)是椎間盤源性疼痛最重要的診斷方法，在診斷椎間盤源性腰痛上，椎間盤造影必須包括4個要素：椎間盤形態(tài)，椎間盤內(nèi)壓力或可注射的液體量，注射時誘發(fā)出主觀感覺的疼痛，相鄰節(jié)段注射時沒有主觀疼痛反應(yīng)，這四個要素缺一不可。椎間盤造影能夠準(zhǔn)確地復(fù)制出平時的疼痛甚至被認(rèn)為是診斷椎間盤源性腰痛的金標(biāo)準(zhǔn)。

椎間盤源性腰痛治療進(jìn)展

非手術(shù)治療：由于IDD最終確認(rèn)診斷需經(jīng)椎間盤造影有創(chuàng)檢查，所以當(dāng)初步印象為IDD時，一般先采用3個月左右的保守治療，保守治療包括臥床休息、腰背肌鍛煉、口服止痛藥、牽引、理療、推拿按摩、針灸、針刀、封閉等。迄今為止尚無高質(zhì)量的研究證明某項保守治療方法與其他或手術(shù)治療相比具有優(yōu)越性。

手術(shù)治療：當(dāng)保守治療無效時，椎間盤造影即為必要的檢查。對于手術(shù)治療時機(jī)及指征，Linson提出癥狀至少持續(xù)l2個月［5］，椎間盤造影疼痛誘發(fā)試驗陽性，在CTD顯示異常形態(tài)學(xué)改變，此為介入治療和手術(shù)治療的指征。

微創(chuàng)治療：經(jīng)皮技術(shù)治療IDD的方法主要有：經(jīng)皮穿刺腰椎間盤摘除術(shù)、椎間盤內(nèi)藥物注射(如亞甲基藍(lán)椎問盤內(nèi)注射)、經(jīng)皮穿刺髓核化學(xué)溶解術(shù)、經(jīng)皮穿刺腰椎間盤內(nèi)臭氧注射術(shù)、經(jīng)皮穿刺腰椎間盤激光消融術(shù)(PLDD)、椎間盤內(nèi)電熱療法(IDET)、椎間盤等離子消融術(shù)、射頻消融和側(cè)后路內(nèi)鏡輔助技術(shù)等。

開放手術(shù)治療椎間盤源性腰痛的手術(shù)治療方法：⑴椎間融合術(shù)：椎間融合術(shù)包括前路椎間融合術(shù)(ALIF)、后路椎間融合術(shù)(PLIF)、經(jīng)椎間孔椎間融合術(shù)(TLIF)融合等。由于椎間融合器械的使用和推廣，椎間Cage融合器和椎弓根釘桿系統(tǒng)逐漸取代了單純植骨融合技術(shù)和單純釘板系統(tǒng)，椎間融合率大幅度提高。目前，椎間融合術(shù)已成為治療椎間盤源性下腰痛的金標(biāo)準(zhǔn)，但高融合率并不一定代表治療的高成功率。臨床長期隨訪結(jié)果顯示，在融合良好的病例中仍有相當(dāng)比例的患者癥狀并未改善，而且椎間融合術(shù)中晚期并發(fā)的鄰近節(jié)段病也是脊柱外科醫(yī)生必須面對的難題之一。⑵非融合一動態(tài)穩(wěn)定手術(shù)：①棘突間固定：一般認(rèn)為，纖維環(huán)后部是椎間盤源性腰痛主要的疼痛來源，棘突間固定可通過撐開脊柱后方結(jié)構(gòu)來減少纖維環(huán)后部的壓力負(fù)荷，恢復(fù)椎間隙的高度，可以減少對竇椎神經(jīng)傷害性神經(jīng)末稍的機(jī)械刺激而緩解疼痛，還可以促進(jìn)纖維環(huán)等機(jī)構(gòu)的恢復(fù)。②人工髓核置換術(shù)：目前在髓核假體中研究最多、使用最廣泛的是PDN假體，該手術(shù)保留了纖維環(huán)、終板及韌帶等結(jié)構(gòu)，手術(shù)創(chuàng)傷小，但髓核假體要求椎間盤纖維環(huán)完整，否則容易造成假體脫出，在很大程度上限制了該手術(shù)的應(yīng)用范圍。③人工椎間盤置換術(shù)(TDR)人工椎間盤置換術(shù)的優(yōu)點在于：徹底切除病變椎間盤，消除椎間盤源性疼痛；恢復(fù)椎間高度，神經(jīng)根能充分活動；恢復(fù)生理前凸，獲得生物力學(xué)平衡；恢復(fù)運(yùn)動功能，防止相鄰節(jié)段退變。

討 論

椎間盤源性腰痛是慢性退行性疾病，對于其病因、發(fā)病機(jī)制、診斷及治療已進(jìn)行了大量的研究，但該疾病與基因的關(guān)系還不明確，還沒有一種比椎間盤造影更加可靠和特異性的診斷方法。目前沒有一種治療方法對所有的椎間盤源性腰痛都有效，而大多數(shù)患者通過保守治療都能夠緩解，這些方法費(fèi)用低，操作簡單，無侵入性，因此保守治療應(yīng)該成為椎間盤源性腰痛治療策略的第一階梯［6］。微創(chuàng)治療具有創(chuàng)傷小，安全可靠，治療效果并不比手術(shù)等其他治療方法差，對保守治療無效的患者，可以考慮IDET、RFA、PLDD等微創(chuàng)手術(shù)治療，盡可能推遲開放性手術(shù)的時間。隨著非融合手術(shù)的研究不斷深入，棘突間固定，人工髓核及人工椎間盤置換術(shù)，取得了較好的短期療效，目前還缺乏長期隨訪和大樣本的研究，但這可以推遲行椎體間融合手術(shù)的時間。近年來，人們發(fā)展了異體椎間盤移植和基因修飾治療椎間盤退變等新方法，前者由于存在早期退變等一系列問題而難以再臨床應(yīng)用；基因治療椎間盤退變尚處于早期的實驗階段，但可以肯定，基因和細(xì)胞水平治療椎間盤源性下腰痛將是以后臨床和基礎(chǔ)研究的重點方向之一。

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第9篇

    1癌癥心理護(hù)理

    大量事實證明,癌癥患者生命期不僅取決于病情和醫(yī)療措施,而且與患者自身的精神狀態(tài)密切相關(guān)。調(diào)查結(jié)果表明:癌癥患者確診后產(chǎn)生否認(rèn)、多疑、緊張、悲觀、恐懼、絕望等負(fù)性情緒,對機(jī)體免疫功能有明顯的抑制作用,嚴(yán)重影響生存率和生活質(zhì)量。所以心理護(hù)理對癌癥患者非常重要,也是整體護(hù)理的核心內(nèi)容,心理護(hù)理質(zhì)量的高低決定著護(hù)理質(zhì)量的高低。和藹的態(tài)度、精湛的技術(shù)、強(qiáng)烈的責(zé)任心是心理護(hù)理的基礎(chǔ)。護(hù)士要盡可能和患者建立起良好的護(hù)患關(guān)系,為患者創(chuàng)造溫馨舒適的生活環(huán)境,解開患者的心結(jié),激發(fā)患者生存欲望,使他們走出心理陰霾,樹立和醫(yī)護(hù)人員緊密配合的心理認(rèn)同感。由于患者的思維層次、溝通意愿和對腫瘤認(rèn)識存在的差異,實現(xiàn)與他們的心靈溝通,護(hù)士要有高度的同情心,理解患者的心理活動規(guī)律,運(yùn)用一定的技巧,根據(jù)患者情況采用相應(yīng)的方法。有移情法、暗示法、開導(dǎo)法、集體心理治療等。要因人而異,有的放矢。

    2癌癥飲食護(hù)理

    由于癌癥導(dǎo)致患者代謝紊亂、負(fù)氮平衡,免疫力低下,白細(xì)胞減少,脫發(fā)等,最終成為惡病質(zhì)。因此對患者進(jìn)行飲食護(hù)理,改善營養(yǎng)狀況十分必要。護(hù)士要采取各種方法鼓勵患者進(jìn)食,經(jīng)常更換食譜,變化烹調(diào)方式,注意色、香、味的調(diào)配,給予高熱量、高蛋白,少油膩、易消化的清淡飲食,少食多餐。每天攝入新鮮蔬菜水果,以提高食欲,補(bǔ)充微量營養(yǎng)素,對進(jìn)行放、化療的患者,要常吃動物肝臟、豬血、瘦肉、黑芝麻,蓮子、大棗、枸杞子、桂圓等,以維持正常的血細(xì)胞數(shù)量和功能;建議多進(jìn)食含鉀高的水果,如苷橘、香蕉等,同時忌煙酒、濃茶、咖啡及粗糙的食物;如果出現(xiàn)咽喉有灼熱感,口干,吞咽困難等口腔粘膜反應(yīng),應(yīng)給患者經(jīng)常漱口,保持口腔濕潤,食物制成肉汁、肉湯一起進(jìn)食,有助于吞咽,從而提高患者的進(jìn)食量。盡力創(chuàng)造干凈、舒適、清潔的病房進(jìn)食環(huán)境。

    3癌癥姑息護(hù)理

    姑息護(hù)理是新興的學(xué)科,是對根治性治療無反應(yīng)的患者積極的整體關(guān)懷護(hù)理,即通過早期識別、積極評估、控制疼痛和治療其他痛苦癥狀,擺脫軀體、心理、社會和宗教的困擾,從而改變患者及親人的生活質(zhì)量。姑息護(hù)理強(qiáng)調(diào)四全服務(wù),即全人、全家、全程、全隊。通過團(tuán)隊的方法提供整體護(hù)理,把患者、家屬作為照護(hù)單元。不主張實施可能給患者增添痛苦和無意義的治療或過度治療,強(qiáng)調(diào)減輕痛苦,讓患者平靜、安然、有尊嚴(yán)地離開人世,即優(yōu)化生命末端質(zhì)量。

    姑息護(hù)理的基本內(nèi)容有:①控制癥狀,特別是控制疼痛,包括PCA技術(shù),WHO推薦癌癥鎮(zhèn)痛三階梯止痛法,藥物阻滯,放射治療,基因治療等。②支持患者,讓患者參與決策,尊重其自主權(quán)。告知病情及進(jìn)程,與患者商量護(hù)理計劃,及時反饋治療效果,提供必要的信息來源和社會支持。③支持家屬,姑息護(hù)理視患者和家屬為整體?；颊哂H屬存在遷就、絕望、厭煩、疑慮、恐懼死亡的心理,護(hù)士應(yīng)同情和理解他們,耐心傾聽他們意見和要求,并指導(dǎo)他們承認(rèn)現(xiàn)實,從容應(yīng)對,在患者面前保持良好心態(tài)。④死亡教育:要讓患者清楚,死亡是人生發(fā)展的必然結(jié)果,從某種意義上講,死亡是痛苦的自然解脫方式。面對死亡,不要惋惜,要順其自然,更無須后顧之憂,親人自會平安生活,未盡事業(yè)后繼有人,讓患者達(dá)到“生如春之燦爛,死如秋之靜美”的境界.4癌癥音樂護(hù)理音樂作為一種非語言性溝通手段,常常在進(jìn)入人的深層意識時,能優(yōu)于單純于運(yùn)用語言治療的方法,起到普通心理療法達(dá)不到的效果。不同樂曲作用于人的感覺器官,產(chǎn)生鎮(zhèn)靜情緒、改善睡眠、增進(jìn)食欲、緩解疼痛等不同作用。

    音樂護(hù)理的方法:①音樂演奏法:由患者自己演奏音樂,以達(dá)到充分散發(fā)壓力和感情的目的。也可以組合演奏。②音樂欣賞法:護(hù)士根據(jù)情況安排一定的時間聽音樂或播放歌曲?；颊咄ㄟ^聽覺、視覺等欣賞音樂,用音樂本身具有的內(nèi)在涵義及魅力幫助患者康復(fù)。

    音樂對癌癥患者生活質(zhì)量有較好的干預(yù)作用。李桂蘭等報道:音樂療法有助于癌癥患者情緒穩(wěn)定,減輕其在化療過程中產(chǎn)生的焦慮、恐懼等不良心理反應(yīng),提高機(jī)體的自我調(diào)節(jié)能力。萬永慧等?認(rèn)為:音樂療法可減少癌癥患者的狀態(tài)焦慮和特質(zhì)焦慮,是一種受患者歡迎的輔助治療方法。王保勝等研究結(jié)果表明:音樂療法可較快改善癌癥患者的焦慮、抑郁的心理狀態(tài),對患者有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛作用,并能減輕因放療引起的惡心、乏力等癥狀。

    5癌癥疼痛護(hù)理

    據(jù)報道每天有350萬以上的癌癥患者有疼痛癥狀,晚期癌癥患者70%左右以疼痛為主訴,其中5O%屬于劇烈疼痛,對患者生存產(chǎn)生極大負(fù)面影響。近年來,國內(nèi)外控制疼痛的方法不斷發(fā)展及完善。

    大家普遍認(rèn)為,護(hù)士首先要掌握癌性疼痛的分級標(biāo)準(zhǔn),英國的Weng—Baker面部表情量表,采用六種面部表情,從微笑到悲傷甚至哭泣來表達(dá)疼痛的程度,各年齡組從三歲至很虛弱的老人,該方法經(jīng)大量使用后,都肯定了其實用性和合理性疼痛護(hù)理方法包括:①建立家庭式病室,給患者創(chuàng)造一個良好的環(huán)境,病室的布置要安靜整潔,優(yōu)美溫馨。②建立良好的護(hù)患關(guān)系,護(hù)士要做到語言文明,舉止端莊,操作熟練,以取得患者的信任,使患者敢于面對現(xiàn)實,積極配合治療,頑強(qiáng)地與疼痛作斗爭。③藥物止痛,在止痛藥的應(yīng)用上要有長期安排,打破按需給藥的舊觀念,采用分階段復(fù)合給藥方式,使疼痛在尚未開始或剛開始便得到控制,保證藥物在體內(nèi)維持一定濃度,這樣不僅能避免劑量的逐漸增大醫(yī)學(xué)教育|網(wǎng)搜集整理,還可減少患者對疼痛的恐懼感。④其他方法:包括患者的自我控制止痛法(PCA)、藥物阻滯,破壞神經(jīng)痛覺通路法及神經(jīng)外科手術(shù)方法等。

    護(hù)士要掌握患者疼痛的信息,正確評估疼痛的程度,根據(jù)患者不同情況,做出及時有效的處理。

    6癌癥社會支持護(hù)理