時間：2023-05-16 16:50:37
導(dǎo)語：在干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的撰寫旅程中，學(xué)習(xí)并吸收他人佳作的精髓是一條寶貴的路徑，好期刊匯集了九篇優(yōu)秀范文，愿這些內(nèi)容能夠啟發(fā)您的創(chuàng)作靈感，引領(lǐng)您探索更多的創(chuàng)作可能。
1 材料和方法:
1. 1 材料
1. 1. 1 主要儀器:CO2培養(yǎng)箱、凈化工作臺、倒置顯微鏡、倒置熒光顯微鏡、共聚焦熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀。
1. 1. 2 主要試劑:DMEM 高糖培養(yǎng)基( Dulbeccosmodified Eagles medium，DMEM)、人表皮生長因子(EGF)、0.25%含 EDTA 的胰蛋白酶(0. 25% trysin-EDTA)、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、抗生素(penicillin，streptomycin)、PBS 緩沖液購自于 Gibco公司。Oct-4、Sox-2、SSEA-4、nestin、vimentin、BDNF、NGF、CD90 購自與 Abcam 公司。CD29、CD44 購自于 eBioscience 公司、CD45、CD11b 購自于 BD 公司。
1. 1. 3 實驗動物:SPF 級孕 18 ～ 18. 5 d 的 SD 大鼠，購自中國軍科院實驗動物中心，許可證號:[SCXK-(軍)2014-0004]，實驗動物使用批準(zhǔn)號:ILAS-PL-2014-001。在無菌條件下進(jìn)行實驗操作分離羊膜組織。
1. 2 方法
1. 2. 1 羊膜細(xì)胞分離及培養(yǎng):SD 孕鼠腹腔注射 1% 戊巴比妥鈉(0. 01 mL /g)，麻醉后，無菌條件下開腹，機(jī)械性分離子宮層，剝離胎盤，分離羊膜組織置于含有500 U/mL 雙抗的 PBS 溶液中沖洗。將羊膜組織放置在含有500 U/mL 雙抗的 DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，無菌眼科剪將其剪至1 mm3左右的小塊。將組織懸液移至50 mL 離心管中，1 000 r/min 離心 5min，棄上清液。加入 0. 25% 含 EDTA 的胰蛋白酶10 mL，37℃ ，5% CO2條件下消化 20 ～30 min。用含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基終止消化。200 目不銹鋼濾網(wǎng)過濾單細(xì)胞懸液，接種至 25 cm2培養(yǎng)瓶，含10% FBS、10 g/LEGF 和 500 U/mL 雙抗的DMEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔天細(xì)胞換液，2 ～ 3 d 后細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶85% ～90%時，進(jìn)行細(xì)胞傳代。
1. 2. 2 流式細(xì)胞術(shù)檢測:取培養(yǎng) 2 ～ 4 代細(xì)胞，用0. 25% 含 EDTA 的胰蛋白酶消化，含 10% FBS 的DMEM 完全培養(yǎng)基終止消化。細(xì)胞計數(shù)將其稀釋成1 106個，每個流式管1 mL 細(xì)胞懸液。每流式管加2 mL PBS 使細(xì)胞混勻，2 000 r/min 離心5 min，棄上清液。重復(fù)加2 mL PBS 重懸細(xì)胞，2 000 r/min離心5 min，棄上清液。每管加 50 L PBS 重懸細(xì)胞，加 抗 體 CD29-PE-Cy7、CD44-PE、CD90-FITC、CD45-PE-CY7、CD11b-APC，避光室溫孵育 30 min。每管加2 mL PBS 重懸細(xì)胞2000 r/min 離心5 min，棄上清液。各管加300 L PBS 重懸細(xì)胞上機(jī)檢測。
1. 2. 3 免疫熒光細(xì)胞染色:取 2 ～ 4 代細(xì)胞，0. 25%含 EDTA 胰蛋白酶消化，含 10% FBS 的 DMEM 完全培養(yǎng)基終止消化。加入完全培養(yǎng)基重懸，至24 孔板中培養(yǎng)。待細(xì)胞增殖至 70% 作用時，PBS 沖洗，4% 多聚甲醛(預(yù)冷)固定 10 min。PBS 沖洗 2 次，每次5 mim。1% Tuiton-100 孵育10 min。PBS 沖洗2 次，每次 5 mim。山羊血清工作液每孔 100 L 室溫下封閉30 min。吸去山羊血清工作液，抗體稀釋液稀釋抗體 Oct-4(1∶ 200)、Sox-2(1∶ 200)、SSEA-4(1∶200)、nestin(1∶100)、vimentin(1∶100)，每孔100L，4℃過夜孵育。PBS 沖洗 3 次，每次 5 min。避光條件下，PBS 稀釋 FITC 標(biāo)記的羊抗鼠二抗(1∶200)，37℃避光孵育 30 min。PBS 沖洗 3 次，每次5 min。DAPI 封片劑封片。共聚焦熒光顯微鏡觀察。
1. 3 統(tǒng)計學(xué)方法實驗結(jié)果采用 x珋 s 表示，使用 SPSS 15.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理，對其進(jìn)行單因素方差分析和LSD 檢驗，P 0. 05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
2 結(jié)果
2. 1 分離細(xì)胞培養(yǎng)分離培養(yǎng)大鼠羊膜細(xì)胞，鏡下，細(xì)胞呈變形蟲樣生長(圖 1a)，生長速度快(圖 1b)，需隔天換液傳代。本實驗中大鼠羊膜細(xì)胞可傳至6 ～7 代。
2. 2 流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表面抗原結(jié)果經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定大鼠羊膜細(xì)胞間充質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)記物 CD29、CD44 分別為97. 6%和95. 8%。細(xì)胞表面抗原CD90、CD45 幾乎不表達(dá)，CD11b 有少量表達(dá)(圖2 見文后彩插6)。
2. 3 細(xì)胞免疫熒光鑒定細(xì)胞表面標(biāo)記物結(jié)果本實驗通過細(xì)胞免疫熒光方法檢測大鼠羊膜細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記物 Oct-4 和 Sox-2(如圖 3)，神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物 nestin 和間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物vimentin(如圖 4)，( 圖 3 ～ 4 見文后彩插 7) 并表達(dá)胚胎干細(xì)胞標(biāo)記物 SSEA-4(如圖 5)?？杀磉_(dá)神經(jīng)營養(yǎng)因子 BDNF 和NGF(如圖6)(圖5 ～6 見文后彩插8)。
3 討論
通過細(xì)胞免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)大鼠羊膜細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)記物 Oct-4 和 Sox-2，間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物 vimentin 和神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記物 nestin，表達(dá) SSEA-4。可表達(dá)神經(jīng)營養(yǎng)因子標(biāo)記物 BDNF 和 NGF，這些神經(jīng)營養(yǎng)因子是神經(jīng)元生長與存活所必需的蛋白質(zhì)分子。羊膜細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物 CD29和 CD44，其表達(dá)量均在95%以上，CD45、CD90 幾乎不表達(dá)，CD11-b 有少量表達(dá)。Oct-4 可參與胚胎干細(xì)胞的自我更新，調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞的多分化潛能。有研究指出 Oct-4 在羊膜細(xì)胞核內(nèi)及細(xì)胞質(zhì)均可表達(dá)。Miki 等人研究結(jié)果表明人羊膜上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞都可表達(dá) Sox-2、Oct-4 等干細(xì)胞標(biāo)志物。本實驗結(jié)果顯示在大鼠羊膜細(xì)胞中 Oct-4 在胞核和胞質(zhì)中均有表達(dá)。Nestin 被認(rèn)為是在胚胎和成體組織中的多能性神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記物。在有絲分裂活躍的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中表達(dá)，現(xiàn)作為神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記物被廣泛應(yīng)用。人羊膜來源的間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)分化，可分化為神經(jīng)樣細(xì)胞并表達(dá) nestin、Oct-4 和 Sox-2。Vimentin 起到維持細(xì)胞形態(tài)，胞質(zhì)完整性和穩(wěn)定細(xì)胞骨架的作用。有研究發(fā)現(xiàn)在妊娠 15 d 的大鼠胚胎中檢測有nestin 和 vimentin 的表達(dá)，人羊膜細(xì)胞未分化的前體細(xì)胞中也存在 nestin、vimentin 表達(dá)。
【摘要】
目的 ：研究糖尿病是否會導(dǎo)致在體外培養(yǎng)條件下自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖、分泌和抗凋亡能力的改變。方法：利用鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)制作成年大鼠糖尿病模型（n=6），正常大鼠作為對照組（n=6），分別于體外利用全骨髓貼壁法來擴(kuò)增和純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，取生長良好的第2代細(xì)胞作為本實驗的研究對象。采用Cell Count kit-8（CCK-8）分別繪制兩組細(xì)胞的生長曲線來評價增殖能力；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和胰島素樣生長因子-1（IGF-1）的分泌量；應(yīng)用Hoechst33342染色和膜聯(lián)蛋白V/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞在低氧無血清條件下的抗凋亡能力。結(jié)果：來源于糖尿病大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖較正常的大鼠顯著性減慢（P
【關(guān)鍵詞】 糖尿病 間充質(zhì)干細(xì)胞 VEGF 細(xì)胞凋亡 增殖 大鼠
Abstract: Objective: To study the effect of diabetic inner environment on the biological properties of marrow mesenchymal stem cells derived from bone(BMSCs). Methods: BMSCs were harvested from the normal and diabetic rats induced by streptozotocin (STZ). Cell proliferation was evaluated using cell counting kit-8 (CCK-8) assay. The secretory volume of vascular endothelial growth factor (VEGF) and insulin-like growth factor (IGF-1) were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and the anti-apoptosis capacity of the cell under the hypoxia and serum deprivation (hypoxia/SD) was detected by Hoechst33342 staining and annexin V/PI dual-color flow cytometry. Results: BMSCs from the diabetic rats induced by STZ could be successfully harvested and expanded in vitro. However they showed more spread-out and flattened appearance and larger size. The proliferative ability of diabetic rats derived from BMSCs were significantly decreased compared with the normal rats (P
Key words: diabetes；mesenchymal stem cells；vascular endothelial growth factor；apoptosis；proliferation；rats
干細(xì)胞治療心肌梗死已被證實是一種較有前景的治療方法。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mar-row mesenchymal stem cells，BMSCs）由于具有取材容易、體外增殖能力強(qiáng)、低免疫原性、可分化為不同類型的成熟細(xì)胞等優(yōu)點[1-2]，成為最佳的移植細(xì)胞來源。但是和其他體細(xì)胞類似，BMSCs也易受各種因素如：年齡、氧化應(yīng)激和高糖[3-4]等的影響而導(dǎo)致其生物學(xué)性狀改變。
糖尿病患者復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境，包括長期的高血糖、高血脂、酮體的增多、活性氧等，勢必會對自身體內(nèi)的BMSCs產(chǎn)生影響[5-6]。目前國內(nèi)外在干細(xì)胞治療心梗的研究中，大多采用正?；蛘吣贻p的BMSCs作為移植細(xì)胞來源。為了確定糖尿病體內(nèi)環(huán)境對BMSCs的影響以及其能否作為自體移植的細(xì)胞來源，我們將以糖尿病大鼠來源的BMSCs作為研究對象，在體外培養(yǎng)條件下進(jìn)行一系列的生物學(xué)特性檢測，就此問題進(jìn)行初步探討。
1 材料和方法
1.1 動物
220 g Spraque Dawley(SD)大鼠由溫州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，所有研究都經(jīng)溫州醫(yī)學(xué)院實驗動物委員會批準(zhǔn)。
1.2 主要試劑
DMEM、胰蛋白酶、胎牛血清購自Gibco公司；鏈脲佐菌素（STZ）、Hoechst 33342購自Sigma公司；細(xì)胞低氧培養(yǎng)盒、缺氧催化劑購自BioM6rieux-sa(France)；膜聯(lián)蛋白 (annexin)-V FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自北京寶賽生物公司；酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自R&D公司。
1.3 糖尿病大鼠模型的制備
12只健康的SD大鼠隨機(jī)平均分為兩組，分別為糖尿病組和正常對照組。兩組大鼠在禁食12 h后分別予單次腹腔注射STZ檸檬酸緩沖液(55 mg/kg)和檸檬酸緩沖液。3 d后剪尾靜脈測血糖，以>16.67 mmol/L視為糖尿病模型成功，腹腔注射后3周復(fù)測1次尾靜脈血糖和體重，以確保血糖濃度>16.67 mmol/L。糖尿病模型合格的和正常對照組大鼠繼續(xù)飼養(yǎng)10周，為下面實驗做準(zhǔn)備。
1.4 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)
無菌條件下分別剝離糖尿病大鼠和正常對照大鼠的股骨和脛骨[3]，以全骨髓貼壁法分離并培養(yǎng)BMSCs，待狀態(tài)良好的第二代細(xì)胞生長達(dá)到70%～80%匯合時可用于以下實驗。
1.5 細(xì)胞增殖能力檢測
取生長良好的第二代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，于96孔板的每個孔中加入100μL細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)為1.5×103，培養(yǎng)基每2天更換一次。于細(xì)胞接種后的7 d內(nèi)，每天取5個孔進(jìn)行檢測，每個孔內(nèi)加入CCK-8試劑10μL，置培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h后，用全自動酶標(biāo)儀檢測490 nm（參比波長630 nm）的吸光度值（OD值），取平均值，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo)，描繪生長曲線。
1.6 間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡的檢測
1.6.1 細(xì)胞模擬缺血處理(無血清和低氧聯(lián)合處理)：當(dāng)?shù)诙?xì)胞生長達(dá)到70%～80%匯合時用PBS沖洗2次，加入不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，然后迅速將細(xì)胞放入密閉低氧罐中，置于37 ℃、5% CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 h。
1.6.2 形態(tài)學(xué)檢測：將進(jìn)行低氧和無血清處理后的細(xì)胞用PBS洗1次，然后加入含Hoechst33342的無血清DMEM培養(yǎng)基，Hoechst33342終濃度為0.1 mg/mL，室溫避光反應(yīng)10 min。用熒光顯微鏡觀察，紫外光激發(fā)，觀察凋亡細(xì)胞并攝片。
1.6.3 流式檢測：取經(jīng)低氧無血清處理的7×105個細(xì)胞，用0.125%胰蛋白酶/0.04% EDTA消化細(xì)胞后，4 ℃，以800 r/min離心4 min后，棄掉上清液；細(xì)胞用PBS沖洗1次后懸浮于200μL結(jié)合緩沖液。然后加入10μL 20μg/mL的異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V(膜聯(lián)蛋白-V-FITC)，輕輕混勻后，4 ℃避光反應(yīng)15 min。加入5μL 50μg/mL的PI，300μL結(jié)合緩沖液，輕輕混勻，用流式細(xì)胞儀檢測活細(xì)胞、早期和中晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞所占的比例。
1.7 血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和胰島素生長因子-1（IGF-1）的ELISA檢測
將生長良好的第二代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用PBS沖洗1次后，添加不含血清DMEM培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 h后，取上清液備用。按照ELISA試劑盒操作說明書，用雙抗體夾心法分別檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF和IGF-1的含量，每份標(biāo)本設(shè)3個復(fù)孔。用全自動酶標(biāo)儀測450 nm處吸光度值，取其平均值，根據(jù)所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出各個細(xì)胞因子的含量。
1.8 統(tǒng)計學(xué)處理方法
采用獨立樣本t檢驗。
2 結(jié)果
2.1 大鼠BMSCs的培養(yǎng)和增殖能力檢測
采用常規(guī)細(xì)胞原代培養(yǎng)法，成功培養(yǎng)了糖尿病大鼠的BMSCs。相差顯微鏡下對細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行了觀察，如圖1A所示培養(yǎng)的原代細(xì)胞呈長梭型，集落生長，中間較密，夾雜著圓形高亮未貼壁的雜細(xì)胞，但是糖尿病大鼠的BMSCs所形成的集落較正常大鼠的明顯要小，而且貼壁后4~5 d才表現(xiàn)出成纖維樣生長特性。細(xì)胞傳代后，在第1代和第2代細(xì)胞生長呈現(xiàn)明顯的漩渦狀，但是相對于正常大鼠BMSCs飽滿的細(xì)胞形態(tài)，糖尿病大鼠的則表現(xiàn)為細(xì)胞伸展無力，且較為扁平。本實驗所用細(xì)胞均為第2代BMSCs。利用CCK-8檢測的結(jié)果顯示(見圖1B)，糖尿病來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力明顯較正常來源的低（P
2.2 VEGF和IGF-1的分泌量
ELISA結(jié)果（見圖2）顯示糖尿病大鼠來源BMSCs的VEGF和IGF-1的分泌量較正常來源的明顯降低(分別為P
2.3 細(xì)胞凋亡
在缺血無血清聯(lián)合處理后(圖3A)，相差顯微鏡照片可以顯示明顯的細(xì)胞凋亡表征，即胞核皺縮變圓，貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯地減少。Hoechst33342染色后，正常細(xì)胞核呈彌散均勻的熒光， 而凋亡的細(xì)胞， 細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中可見濃染致密的顆粒熒光， 被認(rèn)為是典型的凋亡細(xì)胞。
2.4 膜聯(lián)蛋白V/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡膜聯(lián)蛋白
糖尿病來源的BMSCs中早期凋亡細(xì)胞(膜聯(lián)蛋白為V+/PI-）較正常大鼠來源的明顯增多（P 0.05）。
3 討論
隨著冠心病發(fā)病機(jī)制研究的深入，更多的證據(jù)表明，作為代謝綜合征之一的糖尿病和冠心病的發(fā)生有著密切的關(guān)系[5]。而糖尿病患者體內(nèi)的高糖、酮體、氧化產(chǎn)物等有害物質(zhì)的增多，勢必對自體來源的BMSCs的性狀產(chǎn)生影響。在本研究中我們通過利用STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型，在經(jīng)體外培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，糖尿病來源的BMSCs在增殖能力上明顯減弱，并且在細(xì)胞的分泌和抗凋亡能力上也較正常大鼠來源的顯著降低。
在BMSCs治療心肌梗死的研究中，首先要在體外擴(kuò)增得到移植所需的細(xì)胞量。我們在研究中發(fā)現(xiàn)，在原代培養(yǎng)中糖尿病來源細(xì)胞在貼壁后4～5 d才表現(xiàn)出成纖維樣生長的特性，且糖尿病來源的BMSCs的增殖能力明顯降低，并且細(xì)胞較為扁平。原代體外貼壁時間的延長和細(xì)胞形態(tài)的變化說明其對環(huán)境的適應(yīng)能力降低，需要較長的時間來恢復(fù)其生長增殖能力。另外有研究表明，傳代后細(xì)胞變?yōu)楸馄剑哂羞@樣的形態(tài)特征為細(xì)胞衰老的表象[7]，并且與我們所得出的增殖能力的下降是相一致的。
另外在BMSCs移植提高梗死后的心功能上，干細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子被認(rèn)為是提高心功能的主要因素之一[8]，其中VEGF和IGF-1在促進(jìn)新生血管的生成和細(xì)胞增殖方面起著非常重要的作用。我們的研究表明，糖尿病來源的BMSCs其VEGF和IGF-1分泌量較正常來源的明顯降低。Liu等[9]利用高糖培養(yǎng)多功能前體細(xì)胞后，VEGF的分泌量也可以得到類似的結(jié)果，但是其細(xì)胞來源為正常的幼年大鼠。在本實驗中所采用的干細(xì)胞培養(yǎng)條件為正常的培養(yǎng)條件，說明糖尿病的體內(nèi)環(huán)境對糖尿病來源的干細(xì)胞其分泌能力有不可逆的損害作用。另據(jù)研究表明，VEGF和IGF-1在糖尿病患者的腎臟和視網(wǎng)膜以及血液中的濃度明顯高于正常水平[10]，但是糖尿病自身來源的BMSCs所分泌的VEGF和IGF-1較正常的明顯降低，造成這種矛盾的結(jié)果，可能是不同的組織來源的細(xì)胞對于糖尿病內(nèi)環(huán)境的反應(yīng)性不同，并且VEGF和IGF-1在糖尿病腎病和視網(wǎng)膜病變等糖尿病并發(fā)癥的發(fā)展中起著重要的作用。至于細(xì)胞移植后分泌的細(xì)胞因子，是否會加速糖尿病并發(fā)癥的發(fā)展進(jìn)程，需要更深入地研究。
影響干細(xì)胞治療心梗療效的另一重要因素是在干細(xì)胞移植后細(xì)胞在心梗區(qū)的存活率較低，而心肌梗死區(qū)缺血低氧的環(huán)境是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的主要原因。我們采用體外低氧無血清的方法建立細(xì)胞凋亡模型[11]，發(fā)現(xiàn)糖尿病組的抗凋亡能力明顯較正常組下降?，F(xiàn)有的體外研究表明，體外的高糖、丙酮醛類、活性氧產(chǎn)物（ROS）等環(huán)境對細(xì)胞的凋亡起著很大的促進(jìn)作用，而這些因素在糖尿病患者中均存在。另外，VEGF的分泌減少和糖尿病BMSCs在體外培養(yǎng)條件下的所表現(xiàn)出細(xì)胞衰老的形態(tài)學(xué)特征，抗細(xì)胞凋亡能力的下降也起著重要的促進(jìn)作用。
目前關(guān)于糖尿病大鼠來源的BMSCs在增殖、分泌和抗凋亡能力下降方面的確切機(jī)制目前尚不清楚，可能與糖尿病體內(nèi)復(fù)雜的病理生理條件造成干細(xì)胞的線粒體功能障礙[12]、高糖所導(dǎo)致的細(xì)胞復(fù)制性衰老[3]和相應(yīng)的信號通道阻斷等有關(guān)[9]。在本實驗中，我們選擇均為同齡的大鼠作為實驗對象，避免了因年齡不同而造成的誤差；在細(xì)胞培養(yǎng)方面，均在體外正常的培養(yǎng)條件下進(jìn)行，從而可以得出糖尿病對BMSCs的各種生物學(xué)性狀的損害是客觀存在的。
本研究也存在若干不足，如沒有將培養(yǎng)得到的糖尿病BMSCs移植回動物心梗模型體內(nèi)，檢測其對心功能的改善情況。另外，在糖尿病來源的BMSCs在抗凋亡能力、增殖能力和分泌能力損傷的機(jī)制上，沒有做進(jìn)一步的探討，這也是我們下一步實驗的方向。
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放免法檢測胰島素分泌量。結(jié)果: 在大鼠β細(xì)胞素濃度為20～30 mg/L時, 大鼠胰腺干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為胰島樣細(xì)胞團(tuán)的數(shù)量明顯高于對照組; 其胰島素分泌量明顯高于對照組(P<0.01)。結(jié)論: 大鼠β細(xì)胞素具有促進(jìn)胰腺干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為胰島β細(xì)胞并增強(qiáng)其胰島素分泌的作用。
關(guān)鍵詞： β細(xì)胞素; 糖尿病 胰腺干細(xì)胞
胰島移植是治療糖尿病的一個熱點, 但供體的缺乏和存在免疫排斥反應(yīng)限制了其應(yīng)用。胰腺干細(xì)胞能定向分化成胰島細(xì)胞, 這為胰島移植提供了新的材料來源［1］。細(xì)胞生長因子在干細(xì)胞的發(fā)育和分化中發(fā)揮了重要作用。研究表明, β細(xì)胞素（betacellulin, BTC）屬于表皮細(xì)
胞生長因子家族中的一個成員, 具有多種生物學(xué)功能, 胰腺BTC mRNA的高水平表達(dá), 提示BTC可能在胰腺組織的發(fā)育中發(fā)揮重要的生理作用［2, 3］。本研究中通過建立穩(wěn)定的胰腺干細(xì)胞體外培養(yǎng)方法, 將β細(xì)胞素用于胰腺干細(xì)胞的體外培養(yǎng), 觀察其是否能促進(jìn)胰腺干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為成熟的胰島, 為克服胰島移植時的供體短缺提供新的胰島來源。
1 材料和方法
1.1 材料
SD大鼠（體質(zhì)量250 g, 雌雄不限, 飼養(yǎng)于清潔級動物房自由飲水和進(jìn)食, 手術(shù)前1 d禁飲食）由第四軍醫(yī)大學(xué)動物中心提供, Ⅴ型膠原酶、 Histopaque(1.119 kg/L)、Histopaque(1.098)(kg/L)、 Histopaque(1.077 kg/L)、 堿性成纖維細(xì)胞生長因子2(basic fibroblast growth factor 2, bFGF2)、 角朊細(xì)胞生長因子(keratinocyte growth factor, KGF)、 ITS(insulintransferin selenium)購自Sigma公司; 牛血清白蛋白(BSA) 購自杭州四季青生物制品公司; 雙硫腙（dithizone, DTZ）、 二甲基亞砜（DMSO）、 煙堿購
于華美公司; 兔抗小鼠的PDX1和CK19抗體購自北京中山生物工程有限公司; 免疫組化SP檢測試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司; CMRL1066、 DMEM/F12 購于Gibco公司; 胰島素放射免疫分析試劑盒購于北京北方生物技術(shù)研究所; 大鼠β細(xì)胞素由本研究室采用基因工程方法獲得［4］。
1.2 方法
1.2.1 大鼠胰腺干細(xì)胞的分離、 培養(yǎng)
采用宋振順等［5］的方法, 首先以Ⅴ型膠原酶消化成年SD大鼠胰腺組織, 然后采用非連續(xù)密度梯度離
心法純化消化后的胰腺細(xì)胞, 去除胰島細(xì)胞后, 收集外分泌部細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。所獲的細(xì)胞培養(yǎng)在含100 mL/L胎牛血清的CMRL1066培養(yǎng)液中, 其中添加100 U/mL青霉素、 100 g/L鏈霉素、 500 μg/L二性霉素B。第3天將培養(yǎng)液改為DMEM/F12, 其中加入ITS（5 mU/L胰島素+5 mg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白+5 mg/L硒）500 μg/L二性霉素B, 2 g/L牛血清白蛋白、 10 mmol /L煙堿, 0.01 ng/L KGF等。此后每2～3 d換液1次。于相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況和克隆形成情況。
1.2.2 胰腺干細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色
分別取培養(yǎng)3、 7、 14 d后的細(xì)胞爬片, 0.4 g/L多聚甲醛(PFA)固定后, PBS緩沖液沖洗玻片, 分別與兔抗小鼠PDX1、 CK19 抗體4℃反應(yīng)過夜, 二抗及呈色反應(yīng)參照SP試劑盒說明。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色, 顯微鏡觀察, 自來水沖洗, 蘇木精復(fù)染, 中性樹膠封固。陰性對照用PBS代替一抗。
1.2.3 雙硫腙染色與計數(shù)
雙硫腙(DTZ)為螯合劑, 可與鉛、 銅、 鋅等螯合, 人和動物（豚鼠除外）的胰島β細(xì)胞因含有鋅, 雙硫腙染色呈猩紅色, 其他胰島細(xì)胞不著色。配制及染色方法: 用二甲基亞砜（DMSO）配制: DTZ 10 mg溶于10 mL DMSO, 用Hanks（pH7.8）1∶100稀釋, 0.22 μm濾膜過濾, DTZ與胰腺干細(xì)胞培養(yǎng)后轉(zhuǎn)分化形成的克隆混合, 室溫5～10 min后做鏡檢。按胰島的直徑>50 μm計數(shù)染色的胰島樣細(xì)胞團(tuán), <50 μm者不計。
1.2.4 胰島素檢測
胰腺干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化后形成的胰島克隆對葡萄糖刺激有胰島素分泌反應(yīng)。顯微鏡下挑取100個胰島樣細(xì)胞團(tuán)克隆, 培養(yǎng)于24孔培養(yǎng)板, 先用含低糖（5.5 mmol/L）的DMEM/F12培養(yǎng)液在37℃下孵育1 h后, 更換為含高糖（16.7 mmol/L）加煙堿（10 mmol/L）的DMEM/F12培養(yǎng)液在37℃下孵育2 h后, 取培養(yǎng)液上清, 采用放免法測定胰島素含量。
1.2.5 實驗分組
按照實驗方法1.2.1中胰腺干細(xì)胞的培養(yǎng)方法培養(yǎng)大鼠胰腺干細(xì)胞, 并將其設(shè)為正常對照組, 各實驗組中分別加入不同濃度的大鼠β細(xì)胞素, 依次為10、 20、 30、 40、 50 mg/L, 共設(shè)立5個實驗組。
1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理
采用Student t檢驗方法, 應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件完成統(tǒng)計學(xué)分析。
2 結(jié)果
2.1 成人胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞光鏡下形態(tài)學(xué)變化
收獲的非胰島細(xì)胞于24～48 h內(nèi)部分黏著于培養(yǎng)瓶底。在第1～3天換液時, 大量漂浮于培養(yǎng)液中的外分泌細(xì)胞和胰島被棄除。培養(yǎng)5 d內(nèi), 單個貼壁細(xì)胞迅速擴(kuò)增為鵝卵石樣小細(xì)胞片進(jìn)而分裂增殖成單層細(xì)胞。培養(yǎng)第3天改用無血清培養(yǎng)液及加入霍亂毒素, 可明顯地促進(jìn)導(dǎo)管上皮細(xì)胞的生長和抑制成纖維細(xì)胞的污染。細(xì)胞培養(yǎng)第7天胰島樣細(xì)胞芽團(tuán)開始從細(xì)胞片或單層細(xì)胞的中央或邊緣出現(xiàn), 同時鵝卵石樣細(xì)胞片迅速擴(kuò)大。此后大量胰島樣細(xì)胞芽團(tuán)和囊狀細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)。雙硫腙染色呈弱陽性。第21～27天, 大量較成熟的胰島樣結(jié)構(gòu)出現(xiàn),雙硫腙染色強(qiáng)陽性（圖1）。
關(guān)鍵詞：樺木酸；石見穿；人肝癌HepG2細(xì)胞；腫瘤干細(xì)胞；細(xì)胞凋亡
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.02.016
中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）02-0060-05
肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是緊隨肺癌、胃癌、食管癌之后的發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤。最新數(shù)據(jù)顯示，肝癌在60歲以下的男性中屬發(fā)病率最高和死亡率最高的癌癥[1]。由于肝癌的高復(fù)發(fā)、高轉(zhuǎn)移率和化療抗藥性，治療效果并不樂觀。近年來，越來越多的學(xué)者認(rèn)為徹底治愈腫瘤的有效療
法除針對腫瘤組織中的大部分腫瘤細(xì)胞，更重要的是靶向其中的腫瘤干細(xì)胞[2-3]。腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cell，CSC）是腫瘤組織中存在的極小部分細(xì)胞，通常處于靜止?fàn)顟B(tài)，當(dāng)受到細(xì)胞因子等影響時會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，這均源于CSC擁有很強(qiáng)的自我更新及增殖分化的能力。我們前期以S180荷瘤小鼠、H22荷瘤小鼠為模型進(jìn)行體內(nèi)篩選，發(fā)現(xiàn)中藥石見穿具有較好的抗腫瘤作用[4-5]，進(jìn)一步對石見穿進(jìn)行化學(xué)成分分析，發(fā)現(xiàn)樺木酸（betulinic acid，BA）為石見穿發(fā)揮抗腫瘤作用的主要有效成分之一。因此，本實驗觀察BA對人肝癌HepG2腫瘤干細(xì)胞增殖的影響，并從細(xì)胞生長周期和細(xì)胞凋亡兩方面初步探討其抗肝癌的作用機(jī)制。
1 實驗材料
1.1 細(xì)胞株
人肝癌HepG2細(xì)胞株，中國科學(xué)院細(xì)胞庫，目錄號TCHu72。
1.2 主要試劑與儀器
BA（Sigma），5-氟尿嘧啶（5-FU，海普藥業(yè)），胎牛血清（Gibco），DMEM/F12+GlutaMAX-I培B基（Gibco），肝素（Sigma），B27神經(jīng)細(xì)胞生長添加劑（Gibco），堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF，Acro Biosystem），成纖維細(xì)胞生長因子（EGF，Acro Biosystem），BSA（Sigma），青鏈霉素混合液（Solarbio），磷酸鹽緩沖液（HyClone），0.25%胰蛋白酶、DMSO（MP Biomedicals），無酚紅DMEM（Macgene），CCK-8試劑盒（Dojindo），細(xì)胞周期試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），F(xiàn)ITC Annexin V凋亡試劑盒（BD）。MCO175型CO2培養(yǎng)箱（德國Galaxy公司），TH-200型顯微鏡（日本Olympus公司），Stnergy-4型酶標(biāo)儀（美國Biotek公司），IEC-CL31R型離心機(jī)（美國Thermo Fisher公司），NAVISO型流式細(xì)胞儀（美國Bechman Coulter公司），JCSO344型高壓蒸汽滅菌鍋（日本Hirayama公司）。
2 實驗方法
2.1 人肝癌HepG2腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)
參考文獻(xiàn)[6-7]進(jìn)行無血清培養(yǎng)基的制備及人肝癌HepG2腫瘤球干細(xì)胞的培養(yǎng)和傳代。
2.1.1 無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基制備 在DMEM/F12培養(yǎng)基中添加20 ng/mL EGF、10 ng/mL bFGF、2% B27、4 μg/mL肝素、0.4%BSA、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素。
2.1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 正常培養(yǎng)人肝癌HepG2細(xì)胞，胰酶消化無血清培養(yǎng)基重懸，計數(shù)，稀釋為2×103/mL，2.5 mL/孔，則5×103/孔接種于低吸附6孔板。置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1 d后可觀察到有懸浮細(xì)胞球形成。每3 d半量換液。
2.1.3 細(xì)胞傳代 當(dāng)細(xì)胞形成懸浮細(xì)胞球（約6 d），進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將含細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞收集于離心管中，800 r/min離心5 min，1 mL胰酶替代物TrypLE Express消化，加胰酶時吹打幾下稍等片刻，即可加PBS稀釋，離心洗滌2～3次后無血清培養(yǎng)基重懸，再取適量加無血清培養(yǎng)基稀釋培養(yǎng)。
2.2 分組和給藥
正常組：DMEM培養(yǎng)基；對照組：DMEM培養(yǎng)基（含0.01%DMSO）；5-FU組：10 μg/mL 5-FU；BA各劑量組：DMSO為溶劑制備40 mmol/L BA，實驗過程中以1000倍培養(yǎng)液稀釋為40 μmol/L，同時等比對倍稀釋分別得到濃度為20、10、5、2.5、1.25 μmol/L的BA培養(yǎng)液。
2.3 細(xì)胞自我更新能力驗證
收集腫瘤干細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基稀釋為每毫升500個。在低吸附96孔板上每孔加入150 μL無血清培養(yǎng)基，并將稀釋好的腫瘤干細(xì)胞2 μL/孔加入96孔板。鏡下觀察，選取有且僅有1個細(xì)胞的孔每日拍照記錄。
2.4 細(xì)胞增殖檢測
將對數(shù)生長期的人肝癌HepG2腫瘤干細(xì)胞制成1×108/L的細(xì)胞懸液，接種于低吸附96孔板，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后更換不含細(xì)胞因子的DMEM/F12培養(yǎng)基同步化使細(xì)胞處于G0期，24 h后分組處理，分別培養(yǎng)于BA濃度為40、20、10、5 μmol/L的無血清培養(yǎng)基中，每組設(shè)5個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后棄上清液，PBS沖洗1遍后每孔加入配制好的CCK-8試劑120 μL，培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h。將顯色完成的液體轉(zhuǎn)移至正常96孔板中，于酶標(biāo)儀波長490 nm處檢測吸光度（OD）值。計算細(xì)胞抑制率。細(xì)胞抑制率（%）=（對照孔OD值-給藥孔OD值）÷對照孔OD值×100%。
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【關(guān)鍵詞】 人胚胎肺;間充質(zhì)干細(xì)胞; 放射性肺炎
放射性肺損傷是最為常見和嚴(yán)重的胸部放療并發(fā)癥之一，其高發(fā)病率限制了腫瘤的放療劑量，從而使腫瘤治療療效下降，部分重度放射性肺損傷明顯增加了患者的死亡風(fēng)險。因此積極尋找能夠預(yù)防、逆轉(zhuǎn)和治療放射性肺損傷并且副作用小的治療方法成為非常重要的課題。人們在許多組織和器官中都發(fā)現(xiàn)和分離了具有多分化潛能的相應(yīng)干細(xì)胞，但在肺組織證實和分離肺干細(xì)胞的研究進(jìn)展緩慢，呼吸道黏膜上皮及肺泡上皮細(xì)胞終生不斷自我更新，尤其在肺組織嚴(yán)重?fù)p傷以后，上皮更新，促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)，在理論上肯定存在多能干細(xì)胞，人們用同位素標(biāo)記的方法取得了一些肺干細(xì)胞存在的證據(jù)，肺泡上皮Ⅱ型細(xì)胞中可能存在具有干細(xì)胞特征的細(xì)胞類型。本研究通過對人胚肺MSC分離、傳代培養(yǎng)、生物學(xué)特性及多向分化能力的測定，明確了人胚肺MSC的干細(xì)胞特性。通過動物體內(nèi)實驗及體外細(xì)胞培養(yǎng)試驗，證實了人胚肺MSC能有效促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞的生長，且能對放射性損傷后肺上皮細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)〔1，2〕。
1 材料與方法
1.1 MSC的分離和培養(yǎng) 選取15例水囊引產(chǎn)胎兒，胎齡為3～5個月。取胎兒肺臟，用DHanks液反復(fù)沖洗，剪成碎塊，用0.2% Ⅱ型膠原酶(Sigma)消化，37℃、30 min，過100目鋼網(wǎng)，制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為2×106/ml，用含DMEM/F12，MCDB201，2% FCS(Gibco BRL公司)培養(yǎng)液，置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，3 d后換液，棄去非貼壁的細(xì)胞，以后每3天半量換液。當(dāng)細(xì)胞達(dá)80%～90%融合時，0.25%胰酶(Sigma)常規(guī)消化傳代。
1.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及細(xì)胞周期的測定
1.2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 取1～7代MSC，置于有小玻片的3.5cm直徑平皿中，37℃，飽和濕度，5% CO2培養(yǎng)12 d后取出，空氣風(fēng)干，瑞士染色，油鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。
1.2.2 細(xì)胞周期的測定 MSC細(xì)胞周期分析的主要試劑：RNA酶I(TaKaRa)，碘化丙啶(PI，Sigma)。將胎兒MSC消化，70%冷乙醇4℃固定30 min，PBS液洗滌細(xì)胞2遍，5 μg/ml I染色(室溫，5 min)，用流式細(xì)胞儀(FACSVantage型)檢測，Mod FIT軟件分析結(jié)果。用流式細(xì)胞儀測定第11、15代MSC的DNA含量，可見處于G0/G1期的細(xì)胞多，分別為95.34%、95.68%，S期少，分別為4.13%、3.58%。
1.3 免疫組化及PTPCR方法檢測人胚肺MSC向成骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化能力
1.3.1 人胚肺MSC的一般生物學(xué)特性 單個核細(xì)胞培養(yǎng)48～72 h后，在鏡下可見散在的貼壁細(xì)胞，呈典型紡錘樣成纖維細(xì)胞狀，7～10 d形成放射狀克隆，挑出20個克隆分別培養(yǎng)，約1 w形成致密的貼壁細(xì)胞層，細(xì)胞形態(tài)均一，生長速度快，易被胰酶消化，可傳至17代以上，其形態(tài)及生長特點不發(fā)生明顯改變。以下描述中將此類細(xì)胞稱為人胚肺貼壁細(xì)胞(fetal lungderived adherent cell，F(xiàn)LAC)，見圖1。
1.3.2 MSC多系誘導(dǎo)分化的鑒定 FLAC在成脂肪誘導(dǎo)體系中培養(yǎng)3 d，細(xì)胞由成纖維細(xì)胞樣逐漸收縮變短，成為立方形或多角形。連續(xù)培養(yǎng)7 d，鏡下可見細(xì)胞內(nèi)有微小脂滴出現(xiàn)，隨著時間的延長，脂滴逐漸增大融合。培養(yǎng)2 w時，可見融合成團(tuán)的脂滴充滿整個細(xì)胞，誘導(dǎo)2周期后用油紅O染色，可見細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的脂肪被特異的染成紅色，見圖2B。上述細(xì)胞同時表達(dá)脂肪細(xì)胞特異性的PPARγ2。成骨培養(yǎng)中細(xì)胞形態(tài)由原來的梭形變成了立方形，隨著細(xì)胞生長密度的增長形成多層的結(jié)節(jié)結(jié)構(gòu)，而對照中細(xì)胞仍是梭形且呈單層生長;80%～90%的細(xì)胞呈Apase陽性，而對照中的Apase陽性細(xì)胞較少;von Kossa染色發(fā)現(xiàn)在成骨培養(yǎng)有明顯的鈣化基質(zhì)沉積，而對照中未見到此現(xiàn)象;RTPCR分析表明MSC經(jīng)OS誘導(dǎo)分化培養(yǎng)后表達(dá)骨鈣蛋白基因，見圖2C。
1.4 放射性肺炎肺泡上皮細(xì)胞的培養(yǎng) 2BS細(xì)胞條件培養(yǎng)液的獲?。?1)條件培養(yǎng)基1的制備：2BS細(xì)胞培養(yǎng)至當(dāng)細(xì)胞生長融合達(dá)90%時，給予換液，24 h后無菌條件下取其上清，過濾細(xì)胞碎片后備用。(2)條件培養(yǎng)基2的制備：2BS細(xì)胞培養(yǎng)至當(dāng)細(xì)胞生長融合達(dá)90%時，給予換液，同時取C57BL/6小鼠全肺用6MVX線直線加速器進(jìn)行單次照射13 Gy后單個肺細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，24 h后取上清，過濾細(xì)胞碎片后備用。
1.5 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)體外測定人胚肺MSC修復(fù)放射損傷肺組織的能力，對比檢測實驗及對照組TGFβ1的含量
1.5.1 實驗動物和飼養(yǎng)環(huán)境 健康雌性 C57BL/6 小鼠40只，體重(200±20)g，由上海實驗動物研究中心提供，飼養(yǎng)于SPF級大鼠飼養(yǎng)室，受試前籠養(yǎng)7 d以適應(yīng)環(huán)境。
1.5.2 試劑及儀器 大鼠轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFβ1)ELISA試劑盒，為博士德公司產(chǎn)品。SIEMENS PRIMUS KP2型直線加速器由德國西門子公司生產(chǎn)。
1.5.3 動物分組 在照射前1 w將40只雌性，C57BL/6 小鼠，隨機(jī)分作隨機(jī)分為空白組、模型組、實驗組1，實驗組2，每組動物均為10只。
1.5.4 模型建立及實驗方法 空白組：不做任何處理;其余3組均用6MVX線直線加速器進(jìn)行全肺單次照射13 Gy;實驗組1照射后每3日給予尾靜脈注射條件培養(yǎng)液1約0.3 ml;實驗組2照射后每3日給予尾靜脈注射條件培養(yǎng)液2約0.3 ml。
1.5.5 標(biāo)本收集及處理 照射后4 w，每組各隨機(jī)取5只小鼠活體取材。腹腔注射2%戊巴比妥鈉0.12 ml/100 g，將大鼠麻醉后，分別取4 ml腹主動脈血用ELISA方法檢測血清中TGFβ1的水平;將右上肺組織固定于10%緩沖性甲醛液中，常規(guī)制成石蠟切片備用，HE染色后光鏡觀察病理改變。
2 結(jié) 果
2.1 光鏡下觀察組織病理改變 與空白組小鼠比較，模型組小鼠的肺組織照射后存在明顯的病理組織學(xué)改變，早期以急性炎癥反應(yīng)為主，表現(xiàn)為肺充血、水腫、肺間質(zhì)增厚，見圖3A;實驗組1的病理與單純照射組小鼠相似，存在明顯的炎癥反應(yīng)，肺充血、水腫明顯，且肺泡腔內(nèi)可見明顯滲出液，提示炎癥反應(yīng)較重，見圖3B。實驗組2的病理表現(xiàn)則與正常組小鼠接近，炎癥反應(yīng)較輕，僅表現(xiàn)為輕度肺充血，見圖3C。
2.2 照射后各組大鼠血清TGFβ1水平 照射后4 w開始，實驗組1及模型組小鼠血清TGFβ1濃度明顯增高〔(30.25±6.33) ng/ml vs (16.95±2.47) ng/ml〕，實驗組1尤為明顯(P
3 討 論
現(xiàn)階段研究表明，放射性肺炎所致的肺組織損傷不僅僅是單一靶細(xì)胞損傷的結(jié)果，而且是一個有多種細(xì)胞參與、有多種細(xì)胞因子調(diào)控的復(fù)雜過程〔3〕。放射線致使肺泡Ⅱ型細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞受損〔4〕，急性期表現(xiàn)為肺血管特別是毛細(xì)血管損傷，產(chǎn)生充血、水腫和細(xì)胞浸潤，急性改變有可能自行消散，但常引起肺結(jié)締組織增生和纖維化。其中肺組織病理改變是反映肺炎程度的最直觀指標(biāo)，可判斷肺炎的程度，同時也可以篩選預(yù)防與治療的藥物?；A(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，放射性肺損傷可引起肺內(nèi)效應(yīng)細(xì)胞即肺泡巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放多種細(xì)胞因子，介導(dǎo)炎性反應(yīng)，啟動和促進(jìn)肺組織纖維化。其中TGFβ1較為重要，是諸多參與放射性肺損傷因子中頗受關(guān)注的細(xì)胞因子，能夠?qū)⑸镄?yīng)擴(kuò)大，參與放射性肺損傷的發(fā)生與發(fā)展〔4〕。
近年來，干細(xì)胞的研究引起了人們的極大關(guān)注，而成體干細(xì)胞的可塑性研究是干細(xì)胞研究領(lǐng)域的熱點之一，其中發(fā)現(xiàn)最早并且研究最多的是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)。BMSCs是來源于中胚層的一類多能干細(xì)胞，在不同誘導(dǎo)條件下具有向心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)元及肺泡上皮細(xì)胞等分化的多項潛能〔5～7〕。BMSCs可取自自體骨髓，取材方便且體外易于分離培養(yǎng)，對機(jī)體損傷小，免疫原性弱，組織相容性好，這為移植BMSCs替代治療受損組織提供了可能。
放射性肺炎與多種細(xì)胞、生長因子的激活和相互作用有關(guān)。有文獻(xiàn)報道〔8〕，小鼠肺部接受照射后1 d，肺組織中即可出現(xiàn)TGFβ基因和Ⅰ型膠原基因的表達(dá)增多;照射后14 d，其表達(dá)量為第1天的5倍。研究表明，發(fā)生放射性肺損傷患者的血清TGFβ1含量也持續(xù)升高〔9〕，提示血清TGFβ1可作為放射性肺損傷的預(yù)測因子，并且可通過降低血清TGFβ1濃度來減輕肺組織的損傷。本實驗顯示，在照射后初期，小鼠血清TGFβ1濃度就顯著增高，而人胚肺MSC卻能使血清TGFβ1濃度持續(xù)下降，起到減輕放射性肺炎的作用。本研究發(fā)現(xiàn)放射性肺炎是在各種靶細(xì)胞和TGFβ1等細(xì)胞因子的共同作用下相互影響、相互調(diào)節(jié)的。人胚肺MSC可能通過下調(diào)TGFβ1的表達(dá)對急性放射性肺炎起到一定的防治作用，可為臨床提供有關(guān)放射性肺炎治療的新的生物治療方法。
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【摘要】 目的 綜述近年來骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)、定向分化為成骨細(xì)胞的條件及相關(guān)研究進(jìn)展。方法 查閱大量相關(guān)文獻(xiàn)，整理、綜合、分析骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的研究進(jìn)展。結(jié)果 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有增殖和分化潛能，在特定條件下可定向分化為成骨細(xì)胞，目前傾向于多因素聯(lián)合應(yīng)用或序貫使用促進(jìn)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞高效表達(dá)成骨標(biāo)志產(chǎn)物，提高成骨率。結(jié)論 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可滿足骨組織工程中種子細(xì)胞的要求，具有廣闊的發(fā)展前景和臨床應(yīng)用價值。
關(guān)鍵詞 組織工程 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 成骨
骨組織工程學(xué)研究內(nèi)容包括種子細(xì)胞、載體、誘導(dǎo)物質(zhì)以及組織工程化骨組織的臨床應(yīng)用等諸多方面，其中種子細(xì)胞是組織工程研究中首要的、最基本的環(huán)節(jié)。20世紀(jì)70年代中期 ［1］ 就已證實骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow mesˉenchymal stem cells，BMMSCs）具有自我增殖能力和分化潛能，而且BMMSCs具有來源廣泛、取材簡單、分化成骨潛能強(qiáng)等特點，成為目前骨組
織工程種子細(xì)胞研究的重點。
1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)研究進(jìn)展
干細(xì)胞是指那些具有高度增殖和自我更新能力，并能分化為兩種以上不同類型組織細(xì)胞的細(xì)胞;組織干細(xì)胞是指發(fā)育成熟的個體內(nèi)具有多向分化潛能的細(xì)胞，目前比較明確的能夠轉(zhuǎn)化的組織干細(xì)胞主要是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）。Freidenˉstein ［1］ 發(fā)現(xiàn)了骨髓培養(yǎng)中有呈紡錘狀的少量貼壁細(xì)胞，能夠分化形成多種中胚層組織，包括:骨、軟骨、肌腱、肌肉組織、骨髓基質(zhì)結(jié)締組織等，這種形成集落的初始骨髓基質(zhì)細(xì)胞被稱為成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞集落形成單位（Colony forming unit-firbroblastic，CFU-F）。Mingnell ［2］ 認(rèn)為BMMSCs為存在于骨髓基質(zhì)中的非造血來源的細(xì)胞亞群，Ashton ［3］ 稱其為骨髓基質(zhì)成纖維細(xì)胞。BMMSCs對營養(yǎng)條件要求高，而且含量很低，約為0.001%～0.01%，要利用BMMSCs就必需實現(xiàn)其體外分離培養(yǎng)及擴(kuò)增 ［4］ 。BMMSCs培養(yǎng)方法主要有全骨髓培養(yǎng)法和離心培養(yǎng)法，前者是將無菌抽取的骨髓加入培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，原代培養(yǎng)培養(yǎng)物以造血細(xì)胞成分居多，為利于BMMSCs的貼壁生長，可采用DMEN和胎牛血清。胎牛血清終濃度為10%～20%，塑料培養(yǎng)瓶較一般玻璃培養(yǎng)瓶更有利于BMMSCs貼壁生長。有人主張用4%醋酸溶解RBC，去除RBC對BMMSCs的貼壁干擾，但有人認(rèn)為RBC會隨著換液而逐漸被自然去除，對BMMSCs影響不大。細(xì)胞融合后以1:2比例傳代，3～4天換液一次 ［5］ 。離心培養(yǎng)法是根據(jù)骨髓中細(xì)胞成分比重的不同，采用離心分離法提取單核細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。在新鮮無菌的骨髓抽取物中加入抗凝培養(yǎng)液稀釋，以1500～2000r/min離心20～30min，采集交界處的單核細(xì)胞層，PBS洗滌2～3次后，加入培養(yǎng)液接種培養(yǎng)。機(jī)體內(nèi)BMMSC數(shù)量很少，接種數(shù)目太少會影響成骨率，太多對于臨床應(yīng)用又不太現(xiàn)實，每立方厘米載體接種1×10 6 個細(xì)胞就能滿足成骨要求。
目前，三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已在骨組織工程中得到廣泛應(yīng)用，Kinoshita ［6］ 等利用膠原凝膠載體培養(yǎng)BMMSCs，發(fā)現(xiàn)三維的膠原網(wǎng)絡(luò)能有效的刺激成骨細(xì)胞分化;Glowacki ［7］ 等采用培養(yǎng)液灌注造成動力性三維細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境，增加了細(xì)胞的適應(yīng)生存能力及成骨功能。三維細(xì)胞培養(yǎng)能夠有效地種植功能細(xì)胞、保持旺盛的細(xì)胞活性、最大程度地發(fā)揮細(xì)胞的功能。特別是流體力學(xué)刺激可通過PGE 2 途徑將力學(xué)刺激轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，能夠明顯增加成骨細(xì)胞增殖，總蛋白合成和DNA合成增加 ［8］ 。
2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化的研究進(jìn)展
特定條件下，組織干細(xì)胞才能向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨很大程度上依賴于體外培養(yǎng)條件，而且，BMMSCs的定向分化還受到其他多種條件的制約和影響。體外細(xì)胞的分化程度決定著成骨的成敗，加入成骨誘導(dǎo)劑可促使BMMSCs向成骨細(xì)胞分化。化學(xué)物質(zhì)（如Dex、1，25（OH） 2 D 3 、β-GP、維生素C等），細(xì)胞因子（如BMP、TGF-β、bFGF等）可促進(jìn)BMMSCs成骨過程中標(biāo)志產(chǎn)物ALP、BGP、骨橋蛋白、骨涎蛋白等高效表達(dá)及礦化結(jié)節(jié)形成，提高成骨率。迄今為止，對這些誘導(dǎo)物的作用機(jī)制知之甚少，而且不同誘導(dǎo)劑的作用又不盡相同 ［9～11］ 。
大量實驗研究發(fā)現(xiàn):Dex作用于BMMSCs后，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞ALP活性增強(qiáng)，骨鈣素（BGP）、骨涎蛋白、骨橋蛋白的合成明顯增加。Dex可促進(jìn)BMMSCs的成骨分化，早期以促進(jìn)基質(zhì)合成為主，后期以促進(jìn)礦化為主。Dex促進(jìn)成骨的同時，亦誘導(dǎo)細(xì)胞向脂肪分化。Beresford ［10］ 在傳代培養(yǎng)細(xì)胞中加入1，25（OH） 2 D 3 ，則抑制其向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化，骨鈣蛋白mRNA表達(dá)增加，證實向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化占優(yōu)勢，而僅在傳代培養(yǎng)細(xì)胞中加入Dex時，則多向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化，這主要是因為Dex促進(jìn)成骨的同時，能激活BMMSCs表面的糖皮質(zhì)激素受體，而1，25（OH） 2 D 3 通過降低脂肪細(xì)胞晚期基因標(biāo)志物ap2和脂肪的mRNA水平而抑制糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的脂肪形成 ［11］ 。β-GP可釋放磷酸根，為細(xì)胞礦化提供離子環(huán)境，可加速礦化結(jié)節(jié)的形成和骨鈣素的合成。維生素C通過延長Ⅰ型膠原轉(zhuǎn)錄因子的半衰期而最終增加Ⅰ型膠原mRNA的含量 ［9］ 。
BMP、TGF-β、bFGF等細(xì)胞因子在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化增殖中起著重要作用，但作用不一 ［12～14］ 。BMP為特異性的骨生長因子，靶細(xì)胞為血管周圍具有分化能力的間充質(zhì)細(xì)胞，能夠啟動BMMSCs的成骨過程，其作用機(jī)制:促進(jìn)BMMSCs分化為成骨細(xì)胞，引導(dǎo)成骨細(xì)胞成骨表型的表達(dá)。BMP為唯一具有異位成骨能力的生長因子，可誘導(dǎo)誘導(dǎo)性骨祖細(xì)胞（Inducible osteogenic precursor cell，IOPC）向定向性骨祖細(xì)胞（Detenined osteogenic precursor cell，DOPC）分化，這一特征為骨組織工程的臨床應(yīng)用提供了廣闊前景。TGF-β是較強(qiáng)的促成骨分化因子，在體內(nèi)能夠增強(qiáng)BMP的誘導(dǎo)成骨作用。TGF-β主要是通過促間充質(zhì)干細(xì)胞分裂增殖，為BMP提供豐富的靶細(xì)胞;抑制脂肪細(xì)胞生成;促進(jìn)骨細(xì)胞產(chǎn)生Ⅰ型膠原，抑制軟骨細(xì)胞產(chǎn)生Ⅱ型膠原，增強(qiáng)基質(zhì)鈣化及對周圍的成骨細(xì)胞的趨化作用，三方面提高BMMSCs的成骨效應(yīng)。bFGF是一種促進(jìn)血管生成劑，在骨移植時可促進(jìn)局部毛細(xì)血管生長。bFGF能夠促進(jìn)BMMSCs體外培養(yǎng)CFU-F的形成，促進(jìn)細(xì)胞增殖。bFGF可促進(jìn)BMMSCs增殖的同時抑制其向成骨細(xì)胞分化;bFGF對Ⅱ型膠原蛋白的合成有促進(jìn)增殖作用，而對于Ⅰ型膠原的影響比較復(fù)雜，可能bFGF是通過與細(xì)胞膜上bFGF受體結(jié)合及一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)最終激活DNA-結(jié)合蛋白，作用于靶細(xì)胞上特異的bFGF反應(yīng)元件起作用。Kypreos ［14］ 報道bFGF抑制Ⅰ型膠原基因轉(zhuǎn)導(dǎo)可能是由B-myb一種DNA-結(jié)合蛋白介導(dǎo)的，bFGF為具有負(fù)性調(diào)控作用的細(xì)胞因子。Marˉtin ［15］研究表明:bFGF對BMMSCs具有最強(qiáng)的促分裂作用，與BMP-2聯(lián)合應(yīng)用促BMMSCs轉(zhuǎn)化作用強(qiáng)于應(yīng)用單一細(xì)胞因子。骨的生長代謝是由多種細(xì)胞因子、化學(xué)物質(zhì)、物理、生物因素等同時參與調(diào)節(jié)的過程，目前傾向于多因素聯(lián)合應(yīng)用或序貫使用。
隨著多種骨生長因子調(diào)控基因分離成功及成骨機(jī)制的分子水平研究的不斷深入，基因轉(zhuǎn)移技術(shù)廣泛用于骨組織工程領(lǐng)域，通過導(dǎo)入標(biāo)志基因或治療性基因，可致外源性調(diào)節(jié)基因表達(dá)于修復(fù)區(qū)，實現(xiàn)誘導(dǎo)成骨、免疫調(diào)節(jié)或成骨調(diào)控等預(yù)定目的。經(jīng)BMP、TGF-β、潛在性膜蛋白（LMP-1）轉(zhuǎn)染的BMMSCs已成功應(yīng)用于骨組織工程化骨組織的構(gòu)建和骨缺損的修復(fù) ［16］。
3 問題及展望
近年來關(guān)于BMMSCs的研究有了較大發(fā)展，但將BMMˉSCs應(yīng)用于臨床，仍面臨許多問題:（1）BMMSCs體外定向分化培養(yǎng)尚未探索出成熟的方法，分離純化細(xì)胞群的技術(shù)有待進(jìn)一步提高;（2）BMMSCs實驗僅限于自體移植方面，在異體移植免疫反應(yīng)問題上有待進(jìn)一步探索;（3）如何促進(jìn)BMMSCs與載體材料相容生長并成骨的難題有待進(jìn)一步解決。隨著三維細(xì)胞培養(yǎng)移植模型的進(jìn)一步發(fā)展、基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的完善和生物可降解材料的日趨成熟，BMMSCs移植將有更廣闊的前景，骨缺損、骨不連的治療將進(jìn)入一個工程化修復(fù)重建的嶄新領(lǐng)域。
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【關(guān)鍵詞】 心肌細(xì)胞 ;抑瘤活性 ;生物分化誘導(dǎo)
近年來，各國學(xué)者對鼠源性心肌細(xì)胞的生物活性研究很多，尤其是在醫(yī)學(xué)上，鼠源性心肌細(xì)胞的生物活性物質(zhì)有著很好的應(yīng)用前景，為人類征服疾病帶來曙光。目前最熱門的研究就是心肌細(xì)胞的抑瘤活性物質(zhì)和生物分化誘導(dǎo)功能，具有很大的研究價值和展望?，F(xiàn)就目前對鼠源性心肌細(xì)胞的生物活性物質(zhì)研究概括綜述如下。
1 心肌細(xì)胞抑瘤活性物質(zhì)的研究
據(jù)統(tǒng)計目前現(xiàn)有抗癌藥物65%來自天然產(chǎn)物或其衍生物，它們在惡性腫瘤的臨床治療中具有極其重要的作用。在生物界中許多生物體內(nèi)存在著大量天然抑瘤物，隨著科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，越來越多的天然抑瘤物被人類所發(fā)現(xiàn)認(rèn)識，不斷地有新的天然抑瘤物被分離和鑒定出來。其中部分天然抑瘤物已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于惡性腫瘤的預(yù)防和臨床治療中，取得了可喜的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。而最讓人值得期待的是從心肌細(xì)胞中分離和提純更新的無毒副作用的低分子抑瘤物。吳敬波等學(xué)者[1]在心肌細(xì)胞培養(yǎng)液對鼻咽癌細(xì)胞生長的體外實驗中得出結(jié)論：新生大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)液可以選擇性的抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖，心肌微環(huán)境中可能存在某種抑瘤物質(zhì)，這可能是心肌轉(zhuǎn)移瘤罕見性的主要機(jī)制。吳敬波、文慶蓮等學(xué)者[2]在心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液對S-180荷瘤小鼠的抑瘤作用的實驗中得出結(jié)論：心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液在體內(nèi)具有抗腫瘤活性， 且無明顯毒副作用?？梢赃M(jìn)一步實驗研究幫助認(rèn)識惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移機(jī)制。吳敬波、楊麟玲等學(xué)者[3]在心肌細(xì)胞培養(yǎng)液在裸鼠體內(nèi)抑制人鼻咽癌細(xì)胞生長及其機(jī)制的實驗做中得出結(jié)論：心肌細(xì)胞培養(yǎng)液在裸鼠體內(nèi)可以有效抑制鼻咽癌細(xì)胞生長，抑瘤率達(dá)73.4%，其機(jī)制可能為誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡。到目前為止，這方面的研究尚在進(jìn)行中。期待心肌細(xì)胞中所含有的這種(或這類)低分子抑瘤物被分離、純化、鑒定出來，這樣的新型天然抑瘤活性物質(zhì)會為腫瘤提供高效穩(wěn)定的治療，為克服腫瘤帶來新的希望。
2 心肌細(xì)胞生物分化誘導(dǎo)功能的研究
心肌細(xì)胞除了有抑瘤活性以外，在眾多的研究中還發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞還具有生物分化誘導(dǎo)功能。由陳連鳳[4]等人發(fā)明的專利中公開發(fā)明了一種在對干細(xì)胞向襲擊組織細(xì)胞分化中應(yīng)用的生物分化誘導(dǎo)劑，其為含有心肌細(xì)胞生長因子的營養(yǎng)液，由心肌細(xì)胞或心臟組織反復(fù)凍融裂解形成的心肌細(xì)胞裂解液，模擬了心肌微環(huán)境，可誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為心肌樣細(xì)胞還可誘導(dǎo)部分干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞方向分化，很好的建立細(xì)胞間連接，進(jìn)行細(xì)胞傳導(dǎo)，無毒副作用，具有很好的應(yīng)用治療前景。 隨后，很多學(xué)者都在這方面進(jìn)行了大量的實驗研究。包括發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等都可以被心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化向心肌樣細(xì)胞分化。各國學(xué)者都在研究心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化的功能及其機(jī)制，發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞的這種誘導(dǎo)功能為治療心臟疾病，特別是心肌梗死有極大地意義和應(yīng)用前景。
意大利Laura Lagostena等學(xué)者[5] 在培養(yǎng)小鼠骨髓中c - kit +細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的電生理特性實驗的研究表明：小鼠骨髓造血干細(xì)胞的可塑性，可有限轉(zhuǎn)分化成心肌細(xì)胞。德國Christina Mauritz等學(xué)者[6] 在功能性一代鼠心肌細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的實驗中發(fā)現(xiàn)多能干細(xì)胞細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞的功能。相對于胚胎干細(xì)胞，可以推導(dǎo)多能干細(xì)胞的細(xì)胞成形術(shù)與心肌組織工程自體心肌細(xì)胞的功能。美國Alessia Orlandi等學(xué)者[7] 在小鼠臍血CD34干細(xì)胞和心肌細(xì)胞共同培養(yǎng)獲得的細(xì)胞功能特性的實驗中發(fā)現(xiàn)，根據(jù)在他們的實驗條件下，臍血CD34的細(xì)胞共同培養(yǎng)的小鼠心肌細(xì)胞的表現(xiàn)形成了類似心肌細(xì)胞興奮收縮偶聯(lián)的功能。但是人類特有的心臟基因表達(dá)RT - PCR則檢測不到。美國Benedetta A. Pallante[8]等學(xué)者在骨髓Oct3 /4細(xì)胞通過年齡依賴旁分泌機(jī)制分化為心肌細(xì)胞的實驗中發(fā)現(xiàn)：不論年齡，骨髓包含Oct3 / 4的干細(xì)胞具有分化成心肌細(xì)胞的能力.土耳其Zeynep Tokcaer-Keskin[9]等學(xué)者研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞可以在體外培養(yǎng)較短的時間內(nèi)向心肌細(xì)胞分化。這時候可能會提供獲得緊急情況下減少細(xì)胞為基礎(chǔ)的治療，可能以前無法使用。在治療急性心肌梗死(AMI)時，干細(xì)胞移植可以明顯改善心功能。無論從改善心肌細(xì)胞，調(diào)節(jié)的改造，或損傷組織再生的保護(hù)心臟功能是否通過旁分泌機(jī)制，還在研究中。美國的Niladri Mal[10]等學(xué)者通過對間充質(zhì)干細(xì)胞的SDF- 1在心肌梗死后表達(dá)，營養(yǎng)支持心肌細(xì)胞的研究，發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞移植可能產(chǎn)生重大影響有利受傷器官功能獨立的組織再生，SDF - 1的移植，主要是通過介導(dǎo)保護(hù)，而不是在心肌細(xì)胞再生的梗塞區(qū)。美國的Whittemore G. Tingley[11]等學(xué)者在小鼠胚胎干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)AKAP10牽連心律調(diào)節(jié)。人類胚胎干細(xì)胞(HESCs)由于其有潛在的能力，可能成為心臟修復(fù)，無限產(chǎn)生心肌細(xì)胞(CMCs)的重要細(xì)胞。日本的Teruhisa Kawamura[12]等學(xué)者發(fā)現(xiàn)：胚胎干細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞的細(xì)胞需要心臟特異性基因程序激活，而最重要的就是乙酰化與GATA - 4，其參與了胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞。美國的P Gallo[13]等學(xué)者追蹤發(fā)現(xiàn)人類胚胎干細(xì)胞的心肌細(xì)胞分化的啟動子是一個有短肌鈣蛋白慢病毒載體(TNNI3的LVVs)。美國的Nicolas Christoforou[14]學(xué)者小研究鼠胚胎干細(xì)胞衍生的心臟前體細(xì)胞的多能，并促進(jìn)新型心臟基因的鑒定。新西蘭的RA de Weger[15]等作者研究發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞可以作為最好的心臟細(xì)胞移植。美國E. Martin-Rendon[16]等學(xué)者用5氮雜胞苷處理的從臍帶血和骨髓中取得的人間充質(zhì)干細(xì)胞，體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞不會產(chǎn)生高頻率的祖細(xì)胞，結(jié)果從臍帶血中間充質(zhì)干/祖細(xì)胞的分離得到的表型與骨髓干細(xì)胞的類似，異常的CD106，使得臍血干細(xì)胞表達(dá)欠缺，而CD146分子的高表達(dá)使得臍血干細(xì)胞表達(dá)增強(qiáng)。這里的結(jié)果表明這種細(xì)胞不產(chǎn)生足夠頻繁的心肌細(xì)胞修復(fù)心臟。他們在心臟修復(fù)效果很可能是由于旁分泌機(jī)制。美國Sepideh Heydarkhan-Hagvall[17]等學(xué)者研究的目的是確定人類脂肪干細(xì)胞(hASCs到心血管細(xì)胞)分化的關(guān)鍵外部和內(nèi)部參數(shù)，最后發(fā)現(xiàn)人體脂肪干細(xì)胞是一種潛在的心血管細(xì)胞組織工程源。
3 展 望
可以看出，鼠源性心肌細(xì)胞不僅含有效的低分子抑瘤活性物質(zhì)，可以分離、純化、鑒定出來，為腫瘤的預(yù)防和治療提供新的方向;而且具有強(qiáng)大的誘導(dǎo)分化功能，能使不同類型的細(xì)胞，包括胚胎干細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等逐漸向心肌細(xì)胞方向發(fā)展，為各種心臟疾病，特別是心肌梗死的治療帶來希望。它的生物活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了我們的想象，這方面的研究還在繼續(xù)深入進(jìn)行研究中，我們期待有更新更好的發(fā)現(xiàn)，為人類帶來更多的福音。
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[關(guān)鍵詞] 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤；腫瘤干細(xì)胞；CD133；耐藥
[中圖分類號] R739.4 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）05-0012-03
腦膠質(zhì)瘤是常見的原發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤的78%，占成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的50%，是惡性程度最高也是最具侵襲性的腫瘤之一[1，2]。目前腦膠質(zhì)瘤治療主要以最大限度切除實體腫瘤，術(shù)后輔以替莫唑胺化療。化療是目前治療膠質(zhì)瘤及改善預(yù)后的重要手段，但目前的治療效果仍達(dá)不到滿意，其中主要原因是腫瘤細(xì)胞的耐藥性[3]。CD133是腫瘤干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，相關(guān)研究顯示CD133+細(xì)胞具有較強(qiáng)的致瘤能力，CD133+細(xì)胞的多藥耐藥性明顯增強(qiáng)[4]。而MRP-1、MDR1在異質(zhì)性膠質(zhì)瘤的腦腫瘤干細(xì)胞中的高表達(dá)是臨床內(nèi)在性耐藥和個體耐藥的主要原因之一[5]。而GST-π作為腫瘤轉(zhuǎn)化的標(biāo)志物之一，能夠催化谷胱甘肽與親電性的抗癌藥物結(jié)合，通過活性將抗癌藥物排出細(xì)胞，增強(qiáng)腫瘤的耐藥性[6]。本研究初步分析MRP-1、MDR1及GST-π在CD133+腫瘤干細(xì)胞中的表達(dá)，為進(jìn)一步研究確切的耐藥機(jī)制及逆轉(zhuǎn)耐藥提供前期基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1材料與試劑
U251細(xì)胞系（廣州賽業(yè)生物科技公司，貨號：HCGUI-30001），DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購自Hyclone公司，胰蛋白酶（Gibco公司）、免疫磁珠（CD133+）細(xì)胞分選試劑盒、免疫磁珠分選儀購自Miltenyi Biotec公司，CO2恒溫培養(yǎng)箱、-80℃超低溫冰箱。
1.2 U251細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng)
將保存人腦 U251 細(xì)胞的凍存管從-80℃冰箱中取出，立即置于37℃恒溫水浴中，輕輕搖動凍存管使管內(nèi)凍存液快速融化；將含U251細(xì)胞的凍存液移入15 mL無菌離心管中，加入約 5 mL含血清培養(yǎng)基，1000 r/min 離心5 min，棄掉上清液；加入約 3 mL含血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，無菌透氣培養(yǎng)瓶中，置于37℃、體積分?jǐn)?shù) 5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；觀察細(xì)胞的生長情況，每3日更換一次培B液；將U251細(xì)胞在含10%的胎牛血清、青霉素 100 U/mL和鏈霉素100 μg/mL的DMEM 完全培養(yǎng)基中進(jìn)行單層培養(yǎng)，置于37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)傳代。隔日換液1次，每次添加 4 mL培養(yǎng)基，每隔3 d進(jìn)行細(xì)胞傳代。
1.3 CD133+膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分選
收集培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)的球樣U251細(xì)胞，胰酶消化、離心后制備單細(xì)胞懸液，200 μm濾網(wǎng)過濾并計數(shù)。參照免疫磁珠（CD133+）細(xì)胞分選試劑盒、免疫磁珠分選儀操作說明進(jìn)行。
1.4 CD133+膠質(zhì)瘤干細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定
將對數(shù)生長期的U251細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化、離心后吹打成單細(xì)胞懸液，分別用無菌PBS液和DMEM/F12重懸細(xì)胞漂洗1遍，接種到含有EGF （20 ng/mL）、bFGF（20 ng/mL）、LIF（10 ng/mL）、B27（1×）的 DMEM/F12無血清培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞鑒定：取膠質(zhì)瘤干細(xì)胞植入包被有多聚賴氨酸的玻片上，晾干，用PBS沖洗除去殘留培養(yǎng)基；經(jīng)4%多聚甲醛固定，5%山羊血清封閉；分別加入Nestin、β-tubulin 和 GFAP一抗，4℃過夜，加入FITC標(biāo)記二抗，熒光顯微鏡鏡檢。
1.5 RT-PCR檢測MRP-1、MDR1、GST-π mRNA的表達(dá)分析
采用Primer Premier v5軟件設(shè)計MRP-1、MDR1、GST-π引物序列。MRP1 正義鏈：5'-GCAGGGCTACTTCTACACCG-3'，反義鏈：5'-TCATCGCCATCACAGCATTG-3'；MDR1：正義鏈：5'-CCCATCATTGCAATAGCAGG-3'，反義鏈：5'-GTTCAAACTTCTGCTCCTGA-3'；GST-π：正義鏈：5'-CCAATACCATCCTGCGTCAC-3'，反義鏈：5'-TCACTGTTTCCCGTTGCCCAT-3'。后收集細(xì)胞，參照相應(yīng)試劑盒說明書提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄提取cDNA，配制PCR 反應(yīng)體系（20 μL）進(jìn)行PCR反應(yīng)。以相同來源的β-actin為內(nèi)部參照，相對基因表達(dá)量=2-CT（Ct=Ct 靶基因-Ct β-actin，Ct=Ct試驗組-Ct 對照組），每個檢測重復(fù)3次，計算 MRP-1、MDR1、GST-π mRNA表達(dá)量。
1.6統(tǒng)計學(xué)分析
應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以（x±s）表示，多組樣本均數(shù)比較先進(jìn)行正態(tài)分布及方差齊性檢驗，呈正態(tài)分布及方差齊性組間比較采用獨立樣本t檢驗，呈正態(tài)分布但方差不齊組間比較采用近似t檢驗，P
2結(jié)果
2.1膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的鑒定
膠質(zhì)瘤U251干細(xì)胞經(jīng)過Nestin、β-tubulin和GFAP熒光染色進(jìn)行鑒定，結(jié)果U251干細(xì)胞球顯示綠色熒光，呈強(qiáng)陽性表達(dá)。經(jīng)過行GFAP和β-tubulin檢測結(jié)果膠質(zhì)瘤干細(xì)胞球未顯示綠色熒光，呈陰性表達(dá)，經(jīng)過培養(yǎng)基中誘導(dǎo)分化7 d后，膠質(zhì)瘤U251干細(xì)胞GFAP、β-tubulin染色則細(xì)胞均顯示綠色熒光，呈強(qiáng)陽性表達(dá)，見封三圖6。
2.2 RT-PCR 檢測MRP-1、MDR1、GST-π mRNA的表達(dá)分析
RT-PCR研究結(jié)果顯示MRP-1、MDR1、GST-π在CD133+腫瘤干細(xì)胞中呈高度表達(dá)，而在CD133-細(xì)胞中表達(dá)顯著低于CD133+細(xì)胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P
3 討論
膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是中樞系統(tǒng)常見原發(fā)性腫瘤，患者雖及時接受完整的放療和化療聯(lián)合治療，預(yù)后仍較差，生存期H為12～18個月。盡管手術(shù)器械和手術(shù)方法已經(jīng)得到極大改進(jìn)，術(shù)后放療和化療等綜合治療措施也有明顯改善，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的中位生存時間仍無明顯延長[7，8]。因此對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的研究將具有持續(xù)的挑戰(zhàn)性。鑒于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是高度血管化的腫瘤，腫瘤的血管在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中起著重要的作用，因此，對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的血管及其內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行研究顯得非常有意義。
以往研究認(rèn)為，惡性腫瘤的生長依賴于腫瘤的血管生成。據(jù)此，有學(xué)者提出研發(fā)抗腫瘤血管生成藥物達(dá)到治療腫瘤的目的。但是，臨床實踐證明，這些藥物的抗腫瘤效果非常有限并且容易獲得耐藥性[9-11]。因此，為研發(fā)更有效的抗腫瘤血管藥物，我們需要對腫瘤的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行更深入的研究。研究證實在多種實體瘤中均含有極少數(shù)干細(xì)胞樣的細(xì)胞，它們具有無限增殖、自我更新、多向分化的潛能及高致瘤性，這種干細(xì)胞樣細(xì)胞被稱為腫瘤干細(xì)胞。通過體外培養(yǎng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞具有自我增殖、多元分化的潛能。國外研究人員將膠質(zhì)瘤干細(xì)胞與神經(jīng)干細(xì)胞比較，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的自我更新能力以及增殖能力均明顯強(qiáng)于神經(jīng)干細(xì)胞[12，13]。CD133+細(xì)胞在干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有不斷增殖、自我更新和分化的能力。我們在U251細(xì)胞系中分選CD133+細(xì)胞，實驗顯示其在無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基中可以自我更新、無限增殖。經(jīng)鑒定，分選獲取的 CD133+細(xì)胞為膠質(zhì)瘤干細(xì)胞。
MRP基因位于16p13.1染色體上，相關(guān)研究顯示MRP能夠通過改變胞漿和細(xì)胞器的pH值，降低藥物到達(dá)作用部位的濃度，并且能夠逆濃度梯度減少胞內(nèi)藥物濃度進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞耐藥的發(fā)生，它同時也是一種ATP依賴泵，可以通過促進(jìn)谷胱甘肽結(jié)合藥物排出細(xì)胞外而減少細(xì)胞內(nèi)藥物的濃度，最終導(dǎo)致腫瘤耐藥的發(fā)生[11]。而MRP-1、MRP-3基因在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中的表達(dá)明顯增多，與腫瘤耐藥之間的關(guān)系相對肯定，已經(jīng)成為研究和解決腫瘤耐藥現(xiàn)象的重要靶位[14-16]。MDR1作為ABC超家族中的轉(zhuǎn)運體多藥耐藥蛋白1能夠逃脫藥物的殺傷作用，從而導(dǎo)致化療后腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[17]。GST是一組與機(jī)體解毒作用有關(guān)的酶類，其中以GST-π與惡性腫瘤關(guān)系最為密切。GST-π以催化方式降解藥物，以降低抗腫瘤藥物的細(xì)胞毒作用而產(chǎn)生耐藥性[18-20]。本研究結(jié)果證實MRP-1、MDR1、GST-π在CD133+細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，提示CD133+細(xì)胞的耐藥機(jī)制可能與MRP-1、MDR1、GST-π表達(dá)增強(qiáng)有一定的關(guān)系，有可能成為膠質(zhì)瘤干細(xì)胞治療的新靶點，為進(jìn)一步研究腫瘤的耐藥機(jī)制以及腫瘤靶向治療藥物提供支持。
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【摘要】 目的 探討激活骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞的方法，提高肌衛(wèi)星細(xì)胞的產(chǎn)量。方法 取成年Wistar大鼠18只，隨機(jī)分為6組，給大鼠下肢腓腸肌注射心臟毒素，分別于注射心臟毒素后的當(dāng)天、注射后1、2、3、4、5 d提取骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞并計數(shù)，采用免疫熒光方法檢測骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞的純度。結(jié)果 采用Percoll分離液提純細(xì)胞，純度能夠達(dá)到80%。注射心臟毒素后3、4 d骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)最多，與其他時間比較，差異有顯著性（F=5.540，q=4.576～5.829，P
【關(guān)鍵詞】 衛(wèi)星細(xì)胞，骨骼肌;細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)；大鼠，Wistar
骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞屬于成體單能干細(xì)胞，具有很強(qiáng)的分化增殖能力，位于骨骼肌纖維的肌膜和基底膜之間，通常情況下處于靜息狀態(tài)。組織損傷（包括體內(nèi)環(huán)境的改變引起的創(chuàng)傷[1]）后，它們很快游走出來，增生并且融合起到修復(fù)和再生損傷肌纖維的作用。越來越多的研究證實，病變組織移植骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞可以改善癥狀，為心力衰竭、骨壞死、斷肢再生等提供了一種新的治療途徑。本研究旨在尋找合適的方法激活肌衛(wèi)星細(xì)胞，從而提高細(xì)胞產(chǎn)量，為實驗室研究及臨床應(yīng)用提供細(xì)胞來源。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
DMEM/F12（Gibco公司），Percoll分離液（Pharmacia公司），胎牛血清（杭州四季青生物材料研究所），胰蛋白酶、膠原酶Ⅰ（Sigma公司），小鼠抗大鼠Myosin、熒光標(biāo)記羊抗小鼠IgG、多聚賴氨酸（武漢博士德生物工程有限公司），心臟毒素（中鑫東泰納米基因生物技術(shù)有限公司）， 成年Wistar大鼠（青島市藥檢中心）。
1.2 方法
1.2.1 模型制備 取18只大鼠隨機(jī)分6組，各3只。下肢備皮消毒后，在腓腸肌處取3個點，每點注射10 mol/L心臟毒素0.1 mL，分別于注射當(dāng)天、注射后1、2、3、4、5 d處死大鼠。
1.2.2 肌衛(wèi)星細(xì)胞原代提取 取處理過的大鼠消毒、固定后，無菌條件下分別取左右下肢腓腸肌，用PBS沖洗血液，剔除結(jié)締組織，將肌肉組織轉(zhuǎn)移到青霉素小瓶，用眼科剪將其剪為肉糜，然后轉(zhuǎn)移至15 mL的離心管，加入1 g/L的膠原酶Ⅱ約2 mL，在37 ℃水浴中慢速攪拌振蕩消化約60 min，以150目金屬過濾網(wǎng)過濾殘余的肌管，并用PBS反復(fù)沖洗。取洗凈后的肌管加入2.5 g/L胰蛋白酶4 mL消化15min，期間每隔5min震蕩1次，加入4mL培養(yǎng)液中和蛋白酶，1 000 r/min離心10 min，棄上清，2 mL培養(yǎng)液重懸沉淀，以體積分?jǐn)?shù)0.20、0.80的Percoll液非連續(xù)密度梯度離心法離心，室溫、以3000 r/min離心10 min。離心管最上面2 mL為細(xì)胞混合液，其下方8 mL為體積分?jǐn)?shù)0.20的Percoll液，最底層2 mL為體積分?jǐn)?shù)0.80的Percoll液。取體積分?jǐn)?shù)0.20與0.80 Percoll 液分界面處的細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基1 000 r/min離心清洗3次， 放入未用多聚賴氨酸處理的25 mL培養(yǎng)瓶中，置入37 ℃培養(yǎng)箱中孵育60 min，輕輕搖晃后傾倒出尚未貼壁的骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞，計數(shù)并重新接種在預(yù)先用多聚賴氨酸處理過的培養(yǎng)瓶中。
1.3 骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定
將純化后的骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞培養(yǎng)96 h后換液，每3 d換液1次，密度達(dá)40%時用2.5 g/L 的胰蛋白酶進(jìn)行消化， 以1∶2 的比例進(jìn)行傳代。取培養(yǎng)第3代的骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞生長爬片，室溫下通風(fēng)干燥，40 g/L多聚甲醛固定30 min。吉姆薩染色觀察細(xì)胞形態(tài)，免疫熒光染色計算骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞陽性率。
1.4 統(tǒng)計學(xué)處理
采用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)間比較采用方差分析。
2 結(jié)果
2.1 骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞形態(tài)和生長情況
大鼠骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞培養(yǎng)約48 h貼壁，為梭形或紡錘形，呈長軸平行排列，具有明顯的方向性和較好的折光性，后呈現(xiàn)多形性，吉姆薩染色可更清楚地顯示細(xì)胞形態(tài)。體外培養(yǎng)的大鼠骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞在8代以內(nèi)生長穩(wěn)定，超過8代以后骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞生長、分化能力下降。
2.2 免疫熒光染色
以Percoll液非連續(xù)密度梯度離心法分離、提純獲得的肌肌衛(wèi)星細(xì)胞純度能夠達(dá)到80%。剛分離出的原代骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞呈球形， 折光性強(qiáng)；培養(yǎng)2 d時細(xì)胞較少融合，多為橢圓形或圓形核的單核細(xì)胞，少數(shù)亦有雙核，呈梭形和紡錘形;培養(yǎng)4 d的肌衛(wèi)星細(xì)胞密度增大，單個細(xì)胞間相互交聯(lián)成網(wǎng)。采用免疫熒光標(biāo)記羊抗小鼠、小鼠抗大鼠Myosin染色可見約有80%的細(xì)胞染色陽性，呈紡錘形，可見綠色熒光信號。
2.3 注射心臟毒素后不同時間骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量比較
注射心臟毒素后3、4 d骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)最多，與其他時間比較，差異有顯著性（F=5.540，q=4.576～5.829，P
表1 注射心臟毒素后不同時間骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)比較（略）
與注射當(dāng)天比較，F(xiàn)=5.540，*q=5.202、5.829，P
3 討論
骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞是成體骨骼肌中位于肌細(xì)胞膜和基膜之間的具有增殖分化潛力的細(xì)胞[2]，呈扁平狀，有突起，具有移動性，1961 年由MAURO發(fā)現(xiàn)[3]。近年來的研究表明，骨骼肌細(xì)胞是一種有絲分裂后細(xì)胞，不能進(jìn)行有絲分裂， 因而動物出生后肌細(xì)胞數(shù)目不發(fā)生明顯的變化，但體積和核數(shù)目發(fā)生很大變化，其原因主要是由鄰近的肌衛(wèi)星細(xì)胞融入肌細(xì)胞中所致。肌細(xì)胞中DNA量及蛋白質(zhì)合成能力增加， 使肌細(xì)胞得以增粗和增長，并且肌衛(wèi)星細(xì)胞對骨骼肌受創(chuàng)傷后肌纖維的再生和修復(fù)也起著重要作用。一旦骨骼肌組織受損，肌衛(wèi)星細(xì)胞就會被激活，大量分裂、增殖，相互融合形成肌纖維，填補(bǔ)受損部位。進(jìn)一步研究表明，骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞還具有干細(xì)胞抗原 Sca1 和CD34 等干細(xì)胞標(biāo)記， 目前認(rèn)為肌衛(wèi)星細(xì)胞即肌源性干細(xì)胞，屬于成體干細(xì)胞。最新研究顯示，成體干細(xì)胞可以橫向分化為其他類型的細(xì)胞和組織， 為干細(xì)胞的廣泛應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。近年來肌衛(wèi)星細(xì)胞常被用于基因載體和組織工程方面的實驗研究， 因此建立和完善肌衛(wèi)星細(xì)胞的培養(yǎng)方法、獲得高純度細(xì)胞很重要。由于骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞具有取材方便、免疫原性低、移植后存活時間長以及避免了胚胎干細(xì)胞的倫理學(xué)爭論等優(yōu)點， 今后定會在組織工程和基因治療中被廣泛應(yīng)用。由于骨骼肌與心肌同屬橫紋肌，均起源于中胚層，分化過程有相似之處，自身有再生能力，體外易于培養(yǎng)，有較好的耐疲勞性和耐受缺血能力，已成為最優(yōu)選的用于壞死心肌治療的移植細(xì)胞之一。朱洪生等[4]報道，體外誘導(dǎo)骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞，表達(dá)特異性肌鈣蛋白T，并可形成縫隙連接。另外也有文獻(xiàn)報道，將骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞移植入心肌梗死模型可明顯改善心功能[4，5]。呂捷等[6]報道，骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞可用于基因治療。由于骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞在體內(nèi)含量少，所以如何有效地增殖肌衛(wèi)星細(xì)胞成為制約此項技術(shù)應(yīng)用的瓶頸。 轉(zhuǎn)貼于
本實驗采用兩步消化法分離細(xì)胞，膠原酶對纖維結(jié)締組織有良好的消化作用， 可將肌肉組織松解，利于胰蛋白酶將細(xì)胞從基膜消化和分離。分離得到的細(xì)胞為肌衛(wèi)星細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及組織碎片的混合物。其中的組織碎片可以通過換液除去，而成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞作為細(xì)胞雜質(zhì)很難去除。張玉石等[7]報道，利用流式細(xì)胞儀可獲得純度在99%以上的肌衛(wèi)星細(xì)胞。由于實驗條件的限制，本實驗室采用150目金屬網(wǎng)、Percoll細(xì)胞分離液[8]、差速貼壁法進(jìn)行純化， 得到肌衛(wèi)星細(xì)胞純度在80%以上。YABLONKA等[8]報道，肌衛(wèi)星細(xì)胞在體外能夠分化成肌小管、形成橫紋，細(xì)胞融合，甚至可見收縮，可通過這種特異性形態(tài)學(xué)變化鑒定肌衛(wèi)星細(xì)胞。本實驗中控制血清濃度高于10%，細(xì)胞密度低于60%，未見細(xì)胞融合。此外，文獻(xiàn)報道鑒定肌衛(wèi)星細(xì)胞的方法包括: 檢測骨骼肌特異磷酸肌酸激酶CKMM亞型、結(jié)蛋白、肌球蛋白(Myosin)、M鈣黏蛋白及α 橫紋肌肌動蛋白。本實驗采用小鼠抗大鼠單克隆抗體對肌衛(wèi)星細(xì)胞進(jìn)行鑒定。成纖維細(xì)胞與骨骼肌內(nèi)血管的平滑肌細(xì)胞不產(chǎn)生Myosin，由此可與肌衛(wèi)星細(xì)胞鑒別。當(dāng)然，用多種單克隆抗體進(jìn)行免疫標(biāo)記可以更好地對肌衛(wèi)星細(xì)胞進(jìn)行鑒定。本文結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)的骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞開始呈現(xiàn)梭形或紡錘形， Myosin免疫組化檢測顯示SC呈陽性，證實培養(yǎng)細(xì)胞為骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞。
骨骼肌再生模型主要包括：機(jī)械損傷、冰凍或化學(xué)誘導(dǎo)損傷。本實驗向大鼠腓腸肌注射10 mol/L心臟毒素0.1 mL，心臟毒素與肌細(xì)胞膜上的受體結(jié)合后，使膜產(chǎn)生小孔，導(dǎo)致肌細(xì)胞除極及Ca2+內(nèi)流，進(jìn)而使肌細(xì)胞受損，可引起80%～90％的肌肉壞死。蛇毒誘導(dǎo)損傷后，從損傷肌管和吞噬細(xì)胞中局部釋放出生長因子，吸引骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞遷移到受損部位，并引起肌衛(wèi)星細(xì)胞在損傷后的2～3 d內(nèi)廣泛增殖；大約在損傷4～5 d后，肌衛(wèi)星細(xì)胞退出細(xì)胞周期，或自我更新，或形成分化的具有中央細(xì)胞核的肌管。利用這種方法，損傷的骨骼肌組織在損傷后的10 d時間內(nèi)可以基本恢復(fù)。本文結(jié)果說明骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖高峰是骨骼肌受損后的3、4 d。在制作模型后的3～4 d，也就是在細(xì)胞產(chǎn)量最高時收獲細(xì)胞，可為實驗及臨床提供細(xì)胞來源。本文實驗提供了一種簡單并可靠的細(xì)胞擴(kuò)增方法。
綜上所述，骨骼肌化學(xué)損傷可作為增加骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞產(chǎn)量的一種方法。骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞是一種很有前途的成體干細(xì)胞，如何使細(xì)胞增殖到所需數(shù)量是有待解決的問題。而且如何更好地提純及培養(yǎng)骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞也需要我們繼續(xù)研究和探索。
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