時(shí)間：2022-09-27 03:51:56
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【關(guān)鍵詞】噬菌體生物擴(kuò)增法;聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù);結(jié)核;分枝桿菌
【中圖分類號(hào)】R378.91+1【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1007-8517(2010)16-159-2
結(jié)核分枝桿菌感染人體而引發(fā)的結(jié)核病是全球性的嚴(yán)重危害人類的傳染性疾病之一。我國(guó)作為發(fā)展中國(guó)家,結(jié)核病的控制更是任重道遠(yuǎn)。在結(jié)核病控制中,尋求經(jīng)濟(jì),快速,敏感性和特異性較高的結(jié)核菌檢測(cè)方法,為結(jié)核的早期診斷提供依據(jù)是眾多臨床醫(yī)師所希望。目前痰熒光涂片靈敏度較差,并受痰樣本數(shù)和病情的影響,一般認(rèn)為活動(dòng)性肺結(jié)核涂陽(yáng)率約40-50%[1];羅氏培養(yǎng)法陽(yáng)性率較高約50-80%[1],但需要平均時(shí)間約4-8周。本研究通過(guò)PhaB法、熒光涂片法、PCR檢測(cè)法、羅氏培養(yǎng)法檢測(cè)肺泡灌洗液中結(jié)核分枝桿菌,通過(guò)對(duì)照評(píng)價(jià)PhaB法在肺結(jié)核診斷中的使用價(jià)值及優(yōu)缺點(diǎn)。
1資料與方法
1.1臨床資料選取2008-2010年廣州市胸科醫(yī)院疑診初治肺結(jié)核住院患者80例,其中男性35例,女性25例,年齡19～65歲,平均年齡38.5±7.5歲。入選條件:疑診為初治肺結(jié)核并支氣管結(jié)核,未開(kāi)始抗結(jié)核治療;三個(gè)月內(nèi)未接受喹諾酮類和氨基糖甙類抗生素治療。
1.2方法
1.2.1PhaB法結(jié)核分枝桿菌噬菌體生物擴(kuò)增試劑盒(FAST plaue TB)由英國(guó)BDTEC公司生產(chǎn),由上海市金浩科技發(fā)展有限公司提供。
1.2.2支氣管沖洗液標(biāo)本收集按支氣管鏡檢查常規(guī)進(jìn)行術(shù)前準(zhǔn)備和麻醉,通過(guò)胸部CT或胸片初步確定重點(diǎn)檢查部位。氣管鏡經(jīng)鼻腔進(jìn)入,通過(guò)聲門逐步檢查氣管,支氣管。對(duì)鏡下可見(jiàn)病變部位,可先后進(jìn)行支氣管粘膜活檢和支氣管刷檢,隨后進(jìn)行支氣管沖洗,將生理鹽水5～10毫升注入相應(yīng)的肺葉和肺段病變部位進(jìn)行沖洗,用吸引器將沖洗液收集入標(biāo)本瓶中送檢,共2-3次。對(duì)鏡下病變部位不明顯處,將纖支鏡插入病灶最多部位所在的支氣管開(kāi)口按上述方法進(jìn)行刷檢、沖洗,留取標(biāo)本。
1.2.3噬菌體生物擴(kuò)增法按試劑盒(FASTPlaqueTBTM)說(shuō)明書(shū)配制所需試劑,包括培養(yǎng)基-生物添加劑、瓊脂、噬菌體和敏感細(xì)胞等,全部操作在無(wú)菌操作臺(tái)進(jìn)行。肺泡灌洗液洗標(biāo)本的處理:取灌洗液標(biāo)本5ml,加入1倍體積的4%NAOH溶液混勻常溫靜置15min去污染。加入磷酸緩沖液(PH6.8)離心20min,棄去上清液。重懸沉淀物,4000g離心15min,棄去上清液,重懸沉淀物,無(wú)菌條件下吸取1ml重懸液加入孵育管中,37℃孵育24小時(shí)。檢測(cè):每次取1ml處理后的樣品加入各反應(yīng)管中,陰性對(duì)照不加標(biāo)本,陽(yáng)性對(duì)照加入1:1000稀釋度的敏感細(xì)胞液。加入100ul噬菌體溶液在37℃條件下培育1h。在每個(gè)反應(yīng)管中加入100ul強(qiáng)效殺毒劑溶液,上下充分混勻,室溫放置5min后加入5ml培養(yǎng)基-生長(zhǎng)添加劑和1ml敏感細(xì)胞液。將反應(yīng)管中所有反應(yīng)混合物倒入培養(yǎng)皿中,加入5ml融化的瓊脂,快速混勻靜置成型。37℃溫育18-24小時(shí)后觀察結(jié)果。結(jié)果判斷:噬菌斑數(shù)19個(gè)陰性,20個(gè)位陽(yáng)性。
1.2.4其他檢測(cè)方法熒光涂片法:用金胺“O”熒光染色涂片法,熒光顯微鏡檢每50個(gè)視野≥10-99條抗酸桿菌為陽(yáng)性;結(jié)核菌培養(yǎng):用BacT/Alert3D全自動(dòng)分枝桿菌快速培養(yǎng)儀按照儀器使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行臨床標(biāo)本的分離培養(yǎng);熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR檢測(cè)):檢測(cè)沖洗液結(jié)核分枝桿菌DN段,TB-DNA基因拷貝數(shù)量>1×103拷貝/mL陽(yáng)性
1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,用X2檢驗(yàn)比較不同檢測(cè)方法的陽(yáng)性率,P
2結(jié)果
初步診斷為肺結(jié)核合并支氣管內(nèi)膜結(jié)核的,未予抗癆治療的纖支鏡肺泡灌洗液標(biāo)本80例。使用PhaB法、熒光涂片法、PCR檢測(cè)法、羅氏培養(yǎng)法四種檢測(cè)方法,PhaB法陽(yáng)性率58.8%,熒光涂片法陽(yáng)性率為47.5%,PCR檢測(cè)法陽(yáng)性率65%,快速培養(yǎng)法陽(yáng)性率76.3%。其中,PhaB法檢測(cè)陽(yáng)性率明顯高于熒光涂片法,檢驗(yàn)差異有顯著性意義(X2=4.27,P0.05),提示兩者陽(yáng)性檢出率類似;PhaB法與羅氏培養(yǎng)法比較檢驗(yàn)有顯著性差異(X2=12.07,P0.05)。
表一 80例初步診斷肺結(jié)核肺泡灌洗液使用PhaB法、熒光涂片法、PCR檢測(cè)法、羅氏培養(yǎng)法進(jìn)行檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果
方法 標(biāo)本例數(shù) 陽(yáng)性例數(shù) 陽(yáng)性檢出率(%)
①PhaB法 80 47 58.8
②熒光涂片法 80 38 47.5
③PCR檢測(cè) 80 52 65
①③兩種方法聯(lián)合 80 58 72.5
④羅氏培養(yǎng)法 80 61 76.3
PhaB法檢出的47份陽(yáng)性標(biāo)本中,熒光涂片法檢出35例陽(yáng)性;PhaB法檢出的33份陰性標(biāo)本中,熒光涂片法檢出30例陰性。PCR法檢測(cè)的52份陽(yáng)性標(biāo)本中,PhaB法檢出41份,檢出率78.8%;羅氏培養(yǎng)法陽(yáng)性的61例標(biāo)本中,PhaB法檢測(cè)出44份,檢出率72.1%。
表二 80例初步診斷肺結(jié)核肺泡灌洗液使用PhaB法、熒光涂片法、PCR檢測(cè)法、羅氏培養(yǎng)法進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果比較
熒光涂片法 PCR檢測(cè)法 羅氏培養(yǎng)法
陽(yáng)性 陰性 陽(yáng)性 陰性 陽(yáng)性 陰性
PhaB法 陽(yáng)性(n=47) 35 12 45 2 47 0
陰性(n=33) 3 30 7 26 14 19
合計(jì) 38 42 52 28 61 19
3討論
1997年wilson等[2]人發(fā)現(xiàn)眾多的噬菌體中有一種分枝桿菌噬菌體能感染結(jié)核分枝桿菌和少數(shù)幾種非結(jié)核分枝桿菌。在經(jīng)過(guò)處理的標(biāo)本中加入結(jié)核分枝桿菌噬菌體,使噬菌體和分枝桿菌結(jié)合,隨后加入殺毒劑滅活未感染分枝桿菌的噬菌體。噬菌體在受感染的分枝桿菌內(nèi),利用其代謝酶系進(jìn)行大量繁殖。當(dāng)分枝桿菌破裂,大量的子代噬菌體被釋放,感染加入的敏感指示細(xì)菌,在培養(yǎng)基上經(jīng)培養(yǎng)形成噬菌體空斑。當(dāng)空斑數(shù)量>20個(gè)為陽(yáng)性,否則為陰性。陽(yáng)性的標(biāo)本間接提示原標(biāo)本有結(jié)核分枝桿菌或少數(shù)的幾種非結(jié)核分枝桿菌。這構(gòu)成了噬菌體法檢測(cè)分枝桿菌的理論基礎(chǔ)[3]。據(jù)國(guó)外資料報(bào)道,2002年南非Albert[4]等人對(duì)疑似肺結(jié)核患者,以羅氏培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn),噬菌體法對(duì)痰標(biāo)本檢測(cè)的敏感性73%,特異性為99%;巴基斯坦Muzaffar[5]等人用類似方法測(cè)得噬菌體法的敏感性82%,特異性98%;國(guó)內(nèi)于秀麗[6]等人用BACTEC MGIT980快速培養(yǎng)法作為金標(biāo)準(zhǔn),測(cè)得噬菌體法檢測(cè)痰中結(jié)核分枝桿菌的敏感性為86.4%,特異性83.9%。均顯示噬菌體法對(duì)痰中分枝桿菌檢測(cè)有較高的敏感性和特異性。
本研究用噬菌體生物擴(kuò)增法、熒光涂片法、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)、羅氏培養(yǎng)法共4種方法同時(shí)檢測(cè)不同的纖支鏡肺泡灌洗液標(biāo)本80份。PhaB法、熒光涂片法、PCR檢測(cè)法、羅氏培養(yǎng)法陽(yáng)性檢出率分別為58.8%,47.5%,65%,76.3%。PhaB法和熒光涂片法陽(yáng)性率比較,差異有顯著性意義(X2=4.27,P0.05);噬菌體生物擴(kuò)增法以羅氏培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn),結(jié)果提示其敏感性77%,特異性100%,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值100%,陰性預(yù)測(cè)值57.6%。和國(guó)外以痰標(biāo)本PhaB法檢測(cè)報(bào)道結(jié)果相似[4]。聯(lián)合PhaB法和熒光涂片法檢測(cè)敏感性為81.2%,特異性為100%,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值100%,陰性預(yù)測(cè)值57.6%;聯(lián)合PhaB法和PCR檢測(cè)法檢測(cè)敏感性為88.5%,特異性為89.5%,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值96.3%,陰性預(yù)測(cè)值89.5%。提示聯(lián)合PhaB法和PCR檢測(cè)法,能快速診斷肺結(jié)核,有較高的敏感性和特異性,在臨床中可能有較大的實(shí)用價(jià)值。這有待于更大的標(biāo)本量進(jìn)一步驗(yàn)證。
結(jié)核分枝桿菌細(xì)菌學(xué)檢測(cè)是診斷結(jié)核的金標(biāo)準(zhǔn)之一,但患者排菌情況受結(jié)核病發(fā)現(xiàn)時(shí)期較大影響,對(duì)早期以滲出、增殖為主的病理改變,排菌量較小;而發(fā)生壞死,空洞形成的患者相對(duì)排菌量較大。同時(shí)病灶相連的支氣管引流是否通暢也影響遠(yuǎn)端氣管內(nèi)分泌物的排出,影響到痰結(jié)核菌的檢查。本組病例肺泡灌洗液標(biāo)本PhaB法陽(yáng)性檢測(cè)率較高,除了與病例的選擇有關(guān),考慮原因:支氣管鏡檢查對(duì)支氣管、肺泡的機(jī)械性刺激,活檢鉗和毛刷損傷支氣管壁和病灶邊緣,同時(shí)在在纖支鏡活檢和刷檢后灌洗可起到疏通支氣管,促進(jìn)遠(yuǎn)端分泌物的排出。用生理鹽水在病變部位注入遠(yuǎn)端氣道和肺實(shí)質(zhì),接觸病灶范圍較廣,負(fù)壓吸引收集沖洗液較多,細(xì)菌量較大,深部的結(jié)核菌可能被收集到?jīng)_洗液中。肺泡灌洗液對(duì)支氣管有刺激作用,可以誘發(fā)部分患者咳嗽,有利于深部結(jié)核菌的排出,獲得結(jié)核菌的機(jī)會(huì)增多[7]。另外,PhaB法是通過(guò)噬菌體感染結(jié)核分枝桿菌,而結(jié)核分枝桿菌受一些理化因素作用,表面受體發(fā)生細(xì)微變化可能導(dǎo)致不能被噬菌體感染[8]。相對(duì)痰標(biāo)本,肺泡灌洗液標(biāo)本受理化因素影響較小。
總結(jié)噬菌體生物擴(kuò)增法對(duì)肺泡灌洗液標(biāo)本分枝桿菌檢測(cè)的臨床應(yīng)用。PhaB法操作簡(jiǎn)便,獲取結(jié)果快速(2天),相對(duì)熒光涂片法有較高的敏感性和特異性。對(duì)PhaB法分枝桿菌檢測(cè)高特異性,臨床可以用于結(jié)核桿菌和非結(jié)核分枝桿菌的菌種鑒定[9]。針對(duì)噬菌體必須感染活的結(jié)核菌特性,臨床中還可以對(duì)標(biāo)本加入不同的結(jié)核藥,對(duì)照不加藥標(biāo)本,篩查結(jié)核菌株對(duì)不同結(jié)核藥的耐藥性[2]。
參考文獻(xiàn)
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【關(guān)鍵詞】淋病奈瑟菌；沙眼衣原體；解脲支原體；檢測(cè)分析
文章編號(hào)：1009-5519（2008）13-1962-02 中圖分類號(hào)：R446 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A
我們于2000~2002年對(duì)自述泌尿生殖道感染的門診患者開(kāi)展了淋病奈瑟菌（NG）、沙眼衣原體（CT）及解脲支原體（UU）的檢查，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。
1 材料與方法
1.1 標(biāo)本來(lái)源:按常規(guī)方法女性取宮頸分泌物，男性取尿道分泌物、前列腺粹等標(biāo)本。近3年來(lái)在我院門診就診患者共獲取泌尿生殖道標(biāo)本5 008份，其中男性標(biāo)本2 759份，女性標(biāo)本2 249份。
1.2 實(shí)驗(yàn)材料
1.2.1 試劑：TM淋病奈瑟菌分離培養(yǎng)基（浙江軍區(qū)衛(wèi)生防疫站）；解脲支原體液體培養(yǎng)基（廣州萬(wàn)孚生物研究所）；單克隆抗體免疫熒光法沙眼衣原體特異性診斷試劑盒（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒所）；革蘭氏染液（自配）。
1.2.2 器材：消毒男性拭子及女性拭子、載玻片、甲醇、染色濕盒。
1.2.3 儀器： 孵育箱、熒光顯微鏡、光學(xué)顯微鏡，旋轉(zhuǎn)式振蕩器。
1.3 方法：接種：將消毒棉拭子所有的標(biāo)本按淋病奈瑟菌，沙眼衣原體及解脲支原體的順序依次接種。（1）在TM培養(yǎng)基上分區(qū)劃線；（2）再將標(biāo)本涂在無(wú)菌的載玻片上，以甲醇固定10 min，取出后于空氣中充分揮發(fā)；（3）最后將取有標(biāo)本的棉拭子放于解脲支原體液體培養(yǎng)基中輕輕攪動(dòng)后取出。
1.3.1 分離培養(yǎng)和鑒定：（1）接種后將TM培養(yǎng)基置于37 ℃，5%~10% CO2環(huán)境下孵育，18~24 h后，可形成直徑約0.5~1 mm、灰白色、光滑、半透明、呈露滴狀的圓形凸起菌落?？梢删湎扔醚趸福?）試驗(yàn)證實(shí)，然后作生化和免疫鑒定。（2）將固定在玻上的標(biāo)本加抗衣原體熒光抗體25 uI，放入濕盒中，密蓋，置37 ℃溫箱孵育30 min，用含吐溫80的磷酸鹽緩沖液入洗槽中，放旋轉(zhuǎn)式振蕩器振蕩洗滌5 min，共3次，吹干，滴緩沖甘油作鏡油，于熒光顯微鏡下檢查。查見(jiàn)亮綠色，具有典型大小，邊界清晰的圓形顆粒、柱狀細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)亮綠色包涵體，可報(bào)告“衣原體熒光抗體染色陽(yáng)性”。（3）解脲支原體液體培養(yǎng)基置于35 ℃孵育24 h，觀察液體呈紅色清亮即為陽(yáng)性；若不變色，再放24 h觀察，紅色、清亮為陽(yáng)性，不變色為陰性。（4）將已固定的細(xì)菌涂片，按常規(guī)革氏染色后鏡檢。若男性急性尿道炎患者的膿性分泌物中呈現(xiàn)中性粒細(xì)胞內(nèi)外有G-雙球菌，可報(bào)告為“查見(jiàn)G-雙球菌（細(xì)胞內(nèi)外），”具有診斷價(jià)值。
2 結(jié)果
2.1 近3年來(lái)共計(jì)檢測(cè)標(biāo)本5 008份，男性2 759份，3種病原體陽(yáng)性共633份，檢出陽(yáng)性率22.9%；女性2 249份，3種病原體陽(yáng)性共433份，檢出陽(yáng)性率19.3%。
2.2 1 006份陽(yáng)性標(biāo)本中，患者年齡分布：40歲104例占9.8%。3種病原體在不同性別人群中的檢出結(jié)果見(jiàn)表1。
2.3 在檢出的1 006例中NG陽(yáng)性218例占20.5%，CT陽(yáng)性196例占18.4%，UU陽(yáng)性652例占61.1%。
2.4 各種病原體混合感染情況：NG與CT混合感染為18例，陽(yáng)性感染率1.7%，其中男8例，女10例。NG與UU混合感染37例，陽(yáng)性感染率3.5%，其中男13例，女24例。CT與UU混合感染為30例，陽(yáng)性2.8%，其中男20例、女10例。NG、UU與CT混合感染為1例。
3 討論
3.1 隨著國(guó)內(nèi)外交往日益頻繁，性意識(shí)和的改變，性傳播疾病已成為常見(jiàn)疾病，因此，開(kāi)展性病防治、性病監(jiān)測(cè)及開(kāi)展新的檢測(cè)技術(shù)早期診斷，提高檢出率是衛(wèi)生工作者的重點(diǎn)。
3.2 由于男、女生理上的差異，淋病在男性的臨床特征明顯，在門診直接用膿液涂片革蘭氏染色，陽(yáng)性檢出率可達(dá)90%以上，無(wú)需再做細(xì)菌培養(yǎng)。而女性淋病患者，細(xì)菌培養(yǎng)有十分重要的意義。
3.3 本文對(duì)3年來(lái)我院性病門診疑為泌尿生殖道感染患者5 008例。分別或同時(shí)進(jìn)行NG、CT、UU的檢測(cè)，病原檢測(cè)陽(yáng)性者1066例，占被檢人數(shù)的21.3%，陽(yáng)性率由高到低為UU（13%）>NG(4.4%)>CT(3.9%)。UU與NG、CT有顯著性差異（P
3.4 三種病原體的檢出中，陽(yáng)性檢出的最小年齡為4歲，最大為70歲，青壯年是陽(yáng)性檢出的主體；大多集中在20~40歲，占總檢出標(biāo)本的81.1%。應(yīng)加強(qiáng)這一年齡段的健康教育，以提高人們的文化素質(zhì)、法制觀念、性道德觀念以及健康知識(shí)和自我保護(hù)意識(shí)[2]。
3.5 從表1可見(jiàn)，淋病奈瑟菌、沙眼衣原體及解脲支原體混合感染普遍，所以對(duì)尿道炎患者應(yīng)同時(shí)進(jìn)行三項(xiàng)聯(lián)檢測(cè)，防止漏診或誤診現(xiàn)象出現(xiàn)。
參考文獻(xiàn)：
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關(guān)鍵詞：布魯氏桿菌；免疫磁珠；優(yōu)化選擇性培養(yǎng)基
中圖分類號(hào)：S85 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20160932027
布魯氏桿菌，是馬耳他熱和波浪熱的病原菌，每年患者人數(shù)不斷增加，成為流行病學(xué)中高度關(guān)注的致病源。布魯氏桿菌主要通過(guò)畜產(chǎn)品和皮毛加工及養(yǎng)殖接觸傳染，寄生于細(xì)胞內(nèi)，引起機(jī)體免疫力下降，可以導(dǎo)致患者喪失勞作能力和流產(chǎn)等，是食源性疾病中增長(zhǎng)較快的一類致病源[1]。目前活菌培養(yǎng)依然是最好的評(píng)價(jià)布魯氏桿菌感染的方法，只要在標(biāo)本中檢出，就可以確定食品的安全性并對(duì)布魯氏桿菌污染實(shí)現(xiàn)追蹤溯源。
1 材料與方法
1.1 Dynabeads M-280磁珠 （日本DYNAL社產(chǎn)）
EDC solution 液；NHS solution液；BST溶液；MEST洗液；羊布魯氏桿菌；羊布魯氏血清；羊抗兔Ig；馬血清；赤蘚醇；白細(xì)胞介素2；胰蛋白；葡萄糖；煙酸；生物素；維生素B1；D-環(huán)絲氨酸 ；甲基乙醚；多黏菌素B；桿菌肽；放線菌酮；制霉菌素；瓊脂粉。
1.2 磁珠的偶聯(lián)
將2mg 磁珠加入2mL Eppendorf管中，管中加入500uL MEST對(duì)磁粒子進(jìn)行洗滌3次。加入EDC與NHS各2.5mg，調(diào)整反應(yīng)體積為500uL，混勻后37℃恒溫活化0.5h，用MEST洗滌除去未反應(yīng)的活化劑，換管洗滌2次。再用BST液洗滌2次，分散到BST中。加入抗血清300 uL，調(diào)整反應(yīng)體積為500uL，4℃偶聯(lián)20h。用BST液洗滌4次，500μL保存液重懸偶聯(lián)好的抗體磁珠。
Dynabeads M-280 磁珠時(shí)用下列方法處理：取羊抗兔 Ig （G）0.5 mL，加1 mL PBS-Tween溶液混勻。離心，棄去上清液。再加1 mL PBS-Tween 液使磁珠重新分散懸浮其中。加羊布魯氏桿菌免疫血清1mL，4℃垂直于水平面、旋轉(zhuǎn)振蕩18h。上磁，棄液體。消磁，用1 mL洗液清洗，重復(fù)清洗5次。洗凈后免疫磁珠放4℃冰箱備用。
1.3 選擇性培養(yǎng)基配置
葡萄糖0.1g；赤蘚醇 0.2g；胰蛋白?12g；氯化鈉3g；馬血清23mL煙酸 0.5 mg；生物素 0.2 mg；維生素B10.5 mg；D-環(huán)絲氨酸 321.5mg；甲基乙醚1：20000；多黏菌素B 1：4000；桿菌肽 1：25000；放線菌酮1：100000；制霉菌素10000單位；硫酸鋅 2μg；氯化銅1μg；硫酸鈷 2μg；三氯化鐵27μg；三氯化鋁10μg；用蒸餾水定容至1L，pH =6.8。將上述培養(yǎng)基取200 mL添加1.5%瓊脂粉，制備成選擇性培養(yǎng)基，其余分裝成100mL/瓶選擇性增菌液。上述培養(yǎng)基在115℃， 20min條件下滅菌備用。
1.4 樣品測(cè)試
將布魯氏桿菌肉湯增菌后，用血球計(jì)數(shù)板法稀釋到每毫升含菌1×103CFU/mL，然后取0.1 mL分別添加到100g牛奶、100g羊腿肌肉、100g水樣品中，混勻成測(cè)試樣。
將上述樣品分別稱取25g于100 mL增菌液中，37℃、5%CO2條件下進(jìn)行增菌培養(yǎng)24～48h。
1.5 免疫磁珠富集
吸取1mL增菌液，放入含有5mg免疫磁珠管內(nèi)，室溫垂直旋轉(zhuǎn)振蕩20min。上磁架，固定磁珠，棄樣液。加1mL 洗液復(fù)混后同前操作。清洗4～5次后，加100uL PBS-Tween液使免疫磁珠和目標(biāo)混勻備用。
1.6 選擇性分離培養(yǎng)和計(jì)數(shù)
將免疫磁珠混勻后移入標(biāo)準(zhǔn)一次性平板內(nèi)，倒入45℃左右選擇性培養(yǎng)基，搖勻?；蛟陬A(yù)先鋪好的選擇性平板上采用涂布法涂布。將接好種選擇性平板在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24～48h，計(jì)數(shù)。
1.7 培養(yǎng)結(jié)果和比較
挑取10株平板菌落，分別接種在生化管培養(yǎng)，符合以下生化反應(yīng)的為羊布魯氏桿菌：革蘭氏染色-，觸酶+，氧化酶-，葡萄糖-，半乳糖-，阿拉伯糖+，硝酸鹽-，尿酶-，精氨酸-，H2S-，硫堇+，明膠-，吲哚-，MR-，VP-，枸櫞酸鹽-，甘露醇-。
計(jì)算公式：布魯氏桿菌=選擇平板總菌落數(shù)×（陽(yáng)性株÷10），結(jié)果見(jiàn)表1。
2 討論
布魯氏桿菌的檢測(cè)逐步被分子學(xué)檢測(cè)所代替，但是不可否認(rèn)分子學(xué)也存在著弊端，樣品中即便存在布魯氏桿菌的核酸但未必說(shuō)明樣品具有生物可傳染性，經(jīng)典的活菌培養(yǎng)法在確認(rèn)布魯氏桿菌的生物安全性上具有更可靠性。
相比較，采用免疫磁珠聯(lián)合選擇性培養(yǎng)基法檢測(cè)布魯氏桿菌可以極大提高布魯氏桿菌的檢出限，這主要得益于優(yōu)化的培養(yǎng)基豐富了布魯氏桿菌必須的生長(zhǎng)因子及免疫磁珠的富集優(yōu)勢(shì)，使得活菌培養(yǎng)法豐富了布魯氏桿菌的微生物學(xué)研究與檢驗(yàn)方面實(shí)驗(yàn)需要。
參考文獻(xiàn)
重大主題宣傳是新聞媒體促進(jìn)科學(xué)發(fā)展、共創(chuàng)社會(huì)和諧的重要使命，這也是新聞媒體作為黨和政府的喉舌，承擔(dān)主流輿論引導(dǎo)的重大社會(huì)責(zé)任。
網(wǎng)絡(luò)新聞宣傳在報(bào)道重大主題方面尤顯獨(dú)特的方式和優(yōu)勢(shì)。網(wǎng)絡(luò)新聞本質(zhì)上具有同步性、受眾參與性，形式上具有互動(dòng)性、海量性、多媒體性。互聯(lián)網(wǎng)Web2.0超越時(shí)空的開(kāi)放性，讓人們潛在的參與意識(shí)有了爆發(fā)的平臺(tái)：從手機(jī)短信、電子郵件、留言板，到BBS、QQ、MSN、博客、播客，網(wǎng)民們不僅可以互相交流，而且也可以通過(guò)網(wǎng)絡(luò)傳播以自己的思想和語(yǔ)言影響社會(huì)大眾。
如何讓重大主題宣傳產(chǎn)生最大的社會(huì)作用？一個(gè)重要的課題就是要從受眾接受心理出發(fā)，研究重大主題宣傳報(bào)道如何讓受眾入耳、入腦、入心。讓受眾從被動(dòng)接受轉(zhuǎn)為主動(dòng)參與，參加到重大主題宣傳報(bào)道中來(lái)，在參與中接受教益。
受眾參與的時(shí)代特征：
受眾的參與權(quán)、表達(dá)權(quán)、傳播權(quán)，是和諧社會(huì)和諧文化的重要內(nèi)容
Web2.0時(shí)代，新聞采播不再是媒體的專利，任何接觸新聞事件的人員都可能以自己的視角來(lái)觀察和報(bào)道新聞事件，網(wǎng)絡(luò)媒體逐漸成為個(gè)性化傳播平臺(tái)。博客、播客、個(gè)人門戶、手機(jī)報(bào)紙、網(wǎng)絡(luò)互動(dòng)報(bào)刊、互動(dòng)搜索等等內(nèi)容更豐富，互動(dòng)性、個(gè)性化更強(qiáng)的Web2.0 模式更是體現(xiàn)了互聯(lián)網(wǎng)這種新的發(fā)展趨勢(shì)。
受眾主動(dòng)參與重大主題宣傳報(bào)道是時(shí)代的要求。構(gòu)建社會(huì)主義和諧社會(huì)，需要全社會(huì)的共同參與。和諧文化建設(shè)賦予了媒體與受眾關(guān)系的新的含義，和諧文化提倡共建共享，網(wǎng)絡(luò)文化建設(shè)尋求平等參與。受眾是新聞傳播的積極參與者，尊重受眾參與傳播的權(quán)利并積極創(chuàng)造條件，是新聞傳播工作的應(yīng)盡之責(zé)。在主題宣傳報(bào)道時(shí)通過(guò)受眾參與，來(lái)反映和諧社會(huì)建設(shè)中被改變的、將要改變的和期待改變的生活，最大程度地讓百姓感受到建設(shè)和諧社會(huì)中黨和政府的人文關(guān)懷。
相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)期，我們很少將受眾作為傳播權(quán)利主體，媒體總是處于主動(dòng)，受眾處于被動(dòng)。隨著國(guó)家生活中民利的增加，受眾在新聞活動(dòng)中的民主意識(shí)也不斷加強(qiáng)。要真正重視以受眾為中心，不但尊重受眾的知情權(quán)，同時(shí)發(fā)揮受眾的參與權(quán)、表達(dá)權(quán)、傳播權(quán)，這應(yīng)當(dāng)成為和諧新聞文化建設(shè)的一個(gè)重要內(nèi)容。
在全國(guó)“兩會(huì)”報(bào)道中，新華網(wǎng)連續(xù)幾年推出“向總理提問(wèn)”的受眾參與主題。2007年央視《今日關(guān)注》“兩會(huì)”特別節(jié)目連續(xù)15天推出《我有問(wèn)題問(wèn)總理》的板塊?！皟蓵?huì)”期間，共征集到網(wǎng)友提問(wèn)20多萬(wàn)條，點(diǎn)擊率超過(guò)千萬(wàn)。“我有問(wèn)題問(wèn)總理”為何能夠牽動(dòng)千萬(wàn)網(wǎng)民心？隨著網(wǎng)絡(luò)時(shí)代的深入發(fā)展，越來(lái)越多的受眾開(kāi)始借助互聯(lián)網(wǎng)工具平臺(tái)表達(dá)著自己對(duì)國(guó)家崛起的巨大熱情，網(wǎng)絡(luò)民意也逐漸體現(xiàn)出了它無(wú)可替代的優(yōu)越性和廣泛性。無(wú)論你是位居高位的官員，還是普通的國(guó)家公民，借助互聯(lián)網(wǎng)都可能有與總理“面對(duì)面”交流的機(jī)會(huì)，你的意見(jiàn)建議甚至?xí)豢偫聿杉{。網(wǎng)絡(luò)以它獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，能夠跨越時(shí)空的界限匯集多方民意，能夠迅速拉近千家萬(wàn)戶百姓的距離。
受眾參與的新聞性：
受眾參與孕育了“互動(dòng)性新聞”，這是互聯(lián)網(wǎng)新的新聞表現(xiàn)形式
2006年美國(guó)《時(shí)代》周刊年度人物是“You”。全球10億網(wǎng)民手中的鼠標(biāo)，讓《時(shí)代》周刊做出了明智選擇。關(guān)注“你”就是關(guān)注受眾。關(guān)注“你”的感受，吸引“你”的注意力，讓“你”參與到宣傳報(bào)道中來(lái)。
網(wǎng)絡(luò)媒體受眾參與孕育了一種新的新聞表現(xiàn)形式――互動(dòng)性新聞。什么是互動(dòng)性新聞？互動(dòng)性新聞是建立在網(wǎng)絡(luò)媒體交互平臺(tái)上，經(jīng)過(guò)受眾參與互動(dòng)而產(chǎn)生的具有新聞價(jià)值的事實(shí)?；?dòng)性新聞具有鮮明的個(gè)性特征：一是具有傳受雙方互動(dòng)交流的特質(zhì)；二是具有第一時(shí)間、無(wú)限空間和廣泛參與性；三是具有現(xiàn)場(chǎng)（超）文本互動(dòng)和二度傳播效能。
在互聯(lián)網(wǎng)這個(gè)最大、最具開(kāi)放性、最富平等和活力的思想交流平臺(tái)上，受眾作為信息單向接受者的被動(dòng)地位已經(jīng)改變，他們毫無(wú)拘束地發(fā)表自己的意見(jiàn)、要求和愿望，直接參與各種新聞信息和思想觀點(diǎn)的傳播。受眾的參與內(nèi)容成為主題報(bào)道的一個(gè)部分，是對(duì)報(bào)道主題的另一種深化和延伸。受眾互動(dòng)和參與，摒棄了傳統(tǒng)媒體單純的宣傳、教育、告知的功能，最大限度地調(diào)動(dòng)起普通受眾的參與熱情。受眾參與的雙重性，即心理上的間接參與和行為上的直接參與，又最大程度上刺激了受眾的積極性。讓讀者參與到重大主題報(bào)道中來(lái)形成互動(dòng)，能提升重大主題報(bào)道的影響力并形成轟動(dòng)效應(yīng)。
中國(guó)寧波網(wǎng)圍繞紀(jì)念建軍80周年，精心策劃了“我是一個(gè)兵”八個(gè)一系列活動(dòng)主題集約、形體發(fā)散、網(wǎng)民互動(dòng)。充分發(fā)揮網(wǎng)絡(luò)媒體的及時(shí)性、互動(dòng)性、表現(xiàn)多樣等優(yōu)勢(shì)，把主題宣傳與網(wǎng)民參與有機(jī)結(jié)合起來(lái)，有100多萬(wàn)人次直接和間接地參與了主題活動(dòng)，得到了當(dāng)?shù)厥∈蓄I(lǐng)導(dǎo)部門的高度肯定。
原創(chuàng)征文，回味軍旅。在天一論壇、博客開(kāi)設(shè)“我是一個(gè)兵”征文專區(qū)。受眾講述動(dòng)人的軍旅故事，有退伍軍人、軍人家屬、普通百姓等，征文200余篇，評(píng)出優(yōu)秀征文近20篇。建軍感言，真情流露。在天一論壇和手機(jī)報(bào)紙中開(kāi)設(shè)專欄，向全體網(wǎng)友征集“我對(duì)建軍節(jié)的一句話”。市民通過(guò)短信、電話、發(fā)帖、郵件等方式參與，共收集到300余條經(jīng)典感言。軍旅照片，精彩紛呈。舉辦“紅色記憶?我眼中的80年”網(wǎng)上原創(chuàng)圖片展，征集網(wǎng)友原創(chuàng)貼圖，同時(shí)制作了專題頁(yè)面供網(wǎng)友上傳圖片，共收到作品200多份。軍事電影，眾人評(píng)說(shuō)。由網(wǎng)友推薦以軍事為體裁的優(yōu)秀電影共75部。最后由網(wǎng)友投票選出了“我最喜歡的軍事電影”。廣為熟悉的《小兵張嘎》、《上甘嶺》、《地雷戰(zhàn)》、《平原游擊隊(duì)》、《血戰(zhàn)臺(tái)兒莊》、《地道戰(zhàn)》、《閃閃的紅星》榜上有名。經(jīng)典軍歌，風(fēng)采再現(xiàn)。在論壇和網(wǎng)上廣播中向廣大歌友征集“我最喜愛(ài)的一首軍歌”，共百名網(wǎng)友用自唱自錄，老歌新唱等形式翻唱了革命歌曲。調(diào)查互動(dòng)，體現(xiàn)民心。以“我看軍旅生活”為主題，開(kāi)展一次以軍營(yíng)生活為背景的網(wǎng)絡(luò)調(diào)查，就網(wǎng)民關(guān)心的問(wèn)題開(kāi)設(shè)網(wǎng)上問(wèn)卷，上萬(wàn)人次參與。創(chuàng)作網(wǎng)刊，深化主題。制作了建軍八十周年“我是一個(gè)兵”主題網(wǎng)刊，集文字、圖片、音樂(lè)、視頻、互動(dòng)為一體，刊登各項(xiàng)活動(dòng)中的優(yōu)秀作品，回顧系列宣傳活動(dòng)的效果。
受眾參與的互換性：
受眾參與改變傳媒與受眾關(guān)系，主題參與改變了傳媒價(jià)值取向
重大主題宣傳的受眾參與不僅是新聞“三貼近”的具體表現(xiàn)，也是新聞創(chuàng)新的一個(gè)原動(dòng)力。加強(qiáng)主題宣傳的創(chuàng)新策劃，吸引受眾對(duì)新聞媒介的關(guān)注和對(duì)新聞事件、新聞報(bào)道全過(guò)程的參與是重大主題報(bào)道的一個(gè)重要內(nèi)容。受眾的參與需求改變了傳媒與受眾的關(guān)系，也改變著媒體的傳統(tǒng)價(jià)值取向。受眾主動(dòng)參與重大主題報(bào)道反映著新聞媒體傳播取向的轉(zhuǎn)換和互換。