導(dǎo)語：在音標(biāo)學(xué)習(xí)計(jì)劃的撰寫旅程中，學(xué)習(xí)并吸收他人佳作的精髓是一條寶貴的路徑，好期刊匯集了九篇優(yōu)秀范文，愿這些內(nèi)容能夠啟發(fā)您的創(chuàng)作靈感，引領(lǐng)您探索更多的創(chuàng)作可能。

第1篇

關(guān)鍵詞：血液集中化檢測(cè)；標(biāo)本；質(zhì)量；無償獻(xiàn)血；分析

選擇低危的無償獻(xiàn)血是安全血液的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而然，血液檢測(cè)仍然是血液安全保障的重要環(huán)節(jié)之一，血液檢測(cè)的質(zhì)量是否得到保證，標(biāo)本質(zhì)量是關(guān)鍵，標(biāo)本留樣差錯(cuò)、標(biāo)本不足量、標(biāo)本抗凝不好、標(biāo)本溶血等現(xiàn)象均可以直接影響血液檢測(cè)的質(zhì)量，采供血機(jī)構(gòu)實(shí)行血液集中化檢測(cè)， 是優(yōu)化血站資源配置、保證輸血安全的必然措施， 也是血站發(fā)展的必然趨勢(shì)。集中檢測(cè)質(zhì)量更是影響到多個(gè)地區(qū)血液安全，評(píng)估血樣質(zhì)量是血液檢測(cè)的首要任務(wù)之一，我們通過對(duì)不同情況下評(píng)估影響血液樣本質(zhì)量的因素，現(xiàn)報(bào)道如下：

1材料與方法

1.1對(duì)抗凝血樣與非抗凝血樣在試驗(yàn)過程中加樣等環(huán)節(jié)對(duì)試驗(yàn)的影響情況進(jìn)行評(píng)估。

1.2使用不同材料的試管采集血液樣本，觀察血液樣本的溶血情況。

1.3統(tǒng)計(jì)一段時(shí)間血樣采集情況，發(fā)現(xiàn)有多個(gè)組次存在血樣不足量的現(xiàn)象，通過干預(yù)交流，連續(xù)追蹤一段時(shí)間觀察留樣效果。

1.4使用相同材料的試管采集血樣，考察不同距離運(yùn)輸過程對(duì)血液樣本溶血情況的評(píng)估。

2結(jié)果

2.1對(duì)抗凝血樣在試驗(yàn)加樣過程纖維蛋白堵針情況與非抗凝血樣在試，見表1。

2.2分別采用塑料材料的試管和玻璃材料的試管采集血樣，觀察其溶血情況，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

2.3血樣接收過程發(fā)現(xiàn)存在不足量現(xiàn)象，回顧統(tǒng)計(jì)210個(gè)組次，發(fā)現(xiàn)6個(gè)組次存在留樣不足情況 ；對(duì)存在問題與相關(guān)部門協(xié)商并進(jìn)行干預(yù)后，追蹤統(tǒng)計(jì)550組次，僅發(fā)生1個(gè)組次留樣不足情況，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

2.4使用相同塑料材料采集血樣，1h內(nèi)運(yùn)輸并當(dāng)天及時(shí)離心，與2h以上運(yùn)輸并隔夜離心，觀察血液溶血情況，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表4。

3討論

血液樣本留樣是血液試驗(yàn)室檢測(cè)工作的第一步，標(biāo)本的采集與留樣環(huán)節(jié)是整個(gè)血液檢測(cè)工作的關(guān)鍵點(diǎn)，血液樣本的質(zhì)量對(duì)檢驗(yàn)的最終結(jié)果有著至關(guān)重要的影響。血液標(biāo)本留樣目前使用標(biāo)準(zhǔn)化的真空采樣管，容器加塞全密閉，減少工作人員的職業(yè)暴露，提供生物安全性 ；真空管嚴(yán)密性＼潔凈度高，避免血樣污染情況發(fā)生，高速離心過程避免氣溶膠對(duì)試驗(yàn)室的污染，也更方便遠(yuǎn)距離血樣運(yùn)輸。標(biāo)準(zhǔn)采樣管由廠家批量生產(chǎn)，抗凝劑質(zhì)量得到保證。血標(biāo)本的采集和前處理直接影響檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性[1]。表1顯示，非抗凝血樣離心后，有時(shí)纖維蛋白析出容易在檢測(cè)加樣過程發(fā)生堵針現(xiàn)象，對(duì)非抗凝血樣堵針現(xiàn)象進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，與同期使用抗凝血樣進(jìn)行比較，堵針率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。溶血的標(biāo)本，紅細(xì)胞的破壞引起紅細(xì)胞內(nèi)酶類物質(zhì)非特異性反應(yīng)，造成假陽性結(jié)果[1]。采用不同材料的抗凝真空管，內(nèi)容物一致的情況下，玻璃材料的留樣真空管基本少見溶血現(xiàn)象，而塑料材料留樣真空管發(fā)生溶血概率較大，統(tǒng)計(jì)不同材料采樣真空管留樣情況，玻璃試管352管發(fā)生溶血現(xiàn)象2管。塑料試管526管發(fā)生溶血現(xiàn)象26管，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用相同的塑料真空管，采集血樣后1h內(nèi)運(yùn)輸當(dāng)天離心發(fā)生溶血率基本在5%以內(nèi)，而運(yùn)輸距離超過2h以上且第2d離心，發(fā)生溶血率高達(dá)20%以上，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

建議：最好使用玻璃資料的真空留樣管采集血液樣本，可以有效地避免溶血現(xiàn)象的發(fā)生，如果使用塑料真空留樣管，最好段距離采集血液后及時(shí)運(yùn)輸并當(dāng)天及時(shí)離心可以避免更多的溶血現(xiàn)象發(fā)生從而保證血液檢測(cè)的質(zhì)量。微板速率法檢測(cè)ALT對(duì)乳糜、溶血等標(biāo)本檢測(cè)存在一些困難[2]。有報(bào)道[3，4]：全自動(dòng)生化分析儀可以通過設(shè)置自動(dòng)稀釋或者濃縮程序進(jìn)行標(biāo)本的重新檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果可以自動(dòng)覆蓋初次檢測(cè)結(jié)果，極大的提高了檢測(cè)速率和準(zhǔn)確率。同血樣樣本除了溶血、纖維蛋白、凝塊析出等影響檢測(cè)效果的因素外，還有留樣不足現(xiàn)象也是直接影響集中化檢測(cè)報(bào)告發(fā)放的及時(shí)性，對(duì)采集護(hù)士進(jìn)行相關(guān)采集知識(shí)的培訓(xùn)干預(yù)及相關(guān)部門加強(qiáng)巡查管理工作前后，發(fā)生留樣不足量現(xiàn)象有明顯改變，干預(yù)前統(tǒng)計(jì)216組次發(fā)現(xiàn)6組次存在留樣不足，干預(yù)后連續(xù)追蹤550組次才發(fā)現(xiàn)1組次留洋不足情況，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明血樣采集與保留，除了材料因素、運(yùn)輸過程以及操作技術(shù)等因素影響，操作者責(zé)任性、操作核對(duì)等過程也是影響血樣采集質(zhì)量的重要因素。集中檢測(cè)各過程加強(qiáng)管理是保證血液質(zhì)量的關(guān)鍵，尤其是血液標(biāo)本的管理，血液標(biāo)本從采集到實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，運(yùn)輸過程是一個(gè)保持"冷鏈"的過程。參與集中檢測(cè)單位間應(yīng)該制定統(tǒng)一的標(biāo)本采集和運(yùn)送程序，從而保證標(biāo)本采集、運(yùn)輸?shù)募皶r(shí)性和規(guī)范性。按相關(guān)規(guī)定進(jìn)行安全、正確的包裝[5]，避免標(biāo)本運(yùn)輸過程激烈震動(dòng)，防止溶血和外濺，確保標(biāo)本質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)：

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第2篇

【摘要】 目的對(duì)亞洲帶絳蟲膜聯(lián)蛋白B2(Annexins B2)進(jìn)行克隆表達(dá)及免疫學(xué)初步研究。方法利用在線生物信息學(xué)工具從亞洲帶絳蟲成蟲cDNA文庫中篩選出Annexins B2基因，并將該基因克隆到原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)中，在大腸埃希菌BL21/DE3中誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物通過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定，重組后的蛋白用His-鎳蛋白純化柱純化，純化的重組蛋白用Western blotting進(jìn)行免疫學(xué)分析。結(jié)果PCR、雙酶切及重組質(zhì)粒DNA測(cè)序均顯示重組體構(gòu)建成功，并得到高純度的蛋白，且該重組蛋白可被亞洲帶絳蟲、豬帶絳蟲及牛帶絳蟲患者的血清識(shí)別。結(jié)論亞洲帶絳蟲成蟲Annexins B2基因可在原核表達(dá)系統(tǒng)中獲得具有免疫活性的高效表達(dá)。

【關(guān)鍵詞】 亞洲帶絳蟲;膜聯(lián)蛋白B2;基因克隆;免疫反應(yīng)性

ABSTRACT: ObjectiveTo clone and express the gene named as Annexins B2 of Taenia saginata asitica so as to analyze the immunogenicity of its recombinant protein.MethodsBy online analysis of the gene at bioinfomatics websites to identify the gene from the Taenia saginata asiatica full-length cDNA plasmid library， the gene was cloned into prokaryotic expression vector pET-28a(+) and then transformed to E.coli BL21 with IPTG induction. Thereafter， the gene product was analyzed by SDS-PAGE and purified by Ni-NTA affinity chromatography. In addition， the immunoreactivity of the purified recombinant proteins was analyzed by Western blotting.ResultsAs demonstrated by PCR， double enzyme digestion and DNA sequencing indicated that the recombinant plasmid was successfully constructed and highly expressed. The recombinant protein tested with Western blotting analysis could react with Taenia asiatica and Taeniarhynchus saginatus infected patient serum.ConclusionThe Annexins B2 of Taenia saginata asitica has been cloned and expressed in the prokaryotic expression system and the purified protein has been confirmed with immunogenicity.

KEY WORDS: Taenia saginata asiatica; Annexins B2; gene cloning; immunoreactivity

鑒于亞洲帶絳蟲與豬帶絳蟲及牛帶絳蟲在起源、分類學(xué)地位存在的差異[1-2]，本課題組率先構(gòu)建亞洲帶絳蟲成蟲全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒文庫，并對(duì)該蟲進(jìn)行功能基因組的研究工作[3]。本文利用生物信息學(xué)工具從文庫中篩選到了一個(gè)膜聯(lián)蛋白B2(Annexins B2)的同源基因，構(gòu)建了原核表達(dá)載體，并對(duì)其原核表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行免疫學(xué)方面的初步研究。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1血清、載體與菌株3種人體帶絳蟲患者血清取自糞檢陽性的帶絳蟲患者。原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)及大腸埃希菌BL-21/DE3由中山大學(xué)熱帶病防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.1.2主要試劑和工具酶Ex Taq酶(含dNTP)，BamHⅠ，XhoⅠ，T4 DNA連接酶 (大連寶生物工程公司);異丙硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)(美國Promega公司);質(zhì)粒純化試劑盒(廣州東盛科技公司);辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗豬IgG二抗、兔抗人二抗、3，3二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);氯化鈣、氯化鈉等為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2方法

1.2.1Annexins B2基因的識(shí)別及擴(kuò)增將獲得的亞洲帶絳蟲Annexins B2基因進(jìn)行BLASTX分析。并根據(jù)已獲得的該基因全長(zhǎng)編碼序列的開放閱讀框，利用軟件設(shè)計(jì)引物(引物由上海聯(lián)合基因公司合成)，分別帶上BamHⅠ和XhoⅠ的酶切位點(diǎn)進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.2.2重組原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定PCR產(chǎn)物和pET-28a(+)載體分別用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，回收、連接后轉(zhuǎn)入大腸埃希菌BL-21/DE3感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)陽性克隆依次進(jìn)行質(zhì)粒的提取、雙酶切和PCR鑒定，并進(jìn)行重組質(zhì)粒DNA測(cè)序鑒定(測(cè)序由英俊科技股份有限公司完成)。

1.2.3重組蛋白的表達(dá)及純化按照常規(guī)方法進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，考馬斯亮蘭蛋白染色液染色觀察蛋白表達(dá)情況。確定蛋白表達(dá)后，進(jìn)行大量的誘導(dǎo)表達(dá)，并判斷重組蛋白的可溶性，再將樣品加入預(yù)先處理好的Ni-IDA His.Bind樹脂親和層析純化柱中，最后再用PBS 24h透析以去掉過柱時(shí)留下的咪唑。

1.2.4Western blotting分析重組蛋白的免疫反應(yīng)性用3種人體帶絳蟲患者及正常人血清與辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗人IgG進(jìn)行Western blotting鑒定。

2結(jié)果

2.1Annexins B2基因的識(shí)別和序列分析該基因全長(zhǎng)922bp，編碼區(qū)為224～686bp。其最大ORF為其完整編碼區(qū)。

2.2原核重組質(zhì)粒的鑒定將重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，產(chǎn)物行0.8g/L瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果顯示在500bp左右有一清晰條帶，與目的基因大小基本相符。此外，重組質(zhì)粒的測(cè)序報(bào)告表明插入序列與理論序列一致，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖1)。

2.2蛋白表達(dá)及純化結(jié)果將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli BL/DE3中，超聲裂解后SDS-PAGE電泳分析結(jié)果顯示在大約25ku處出現(xiàn)高效表達(dá)條帶(圖2)，與目的蛋白基本相符。測(cè)得純化產(chǎn)物的蛋白濃度為0.526g/L。

2.3Western blotting鑒定純化蛋白的免疫反應(yīng)性

用感染亞洲帶絳蟲、豬帶絳蟲、感染牛帶絳蟲的患者血清以及亞洲帶絳蟲感染豬的血清與純化蛋白反應(yīng)的結(jié)果均顯示出較清晰的條帶，而陰性對(duì)照血清在相應(yīng)位置未識(shí)別出該蛋白條帶(圖3)，表明該表達(dá)產(chǎn)物具有良好的免疫反應(yīng)性。圖1重組質(zhì)粒的PCR和雙酶切鑒定

Fig.1 The identification of the pET-28a(+)-Ta Annexins B2 by PCR amplification and digestion with restriction enzymesM1：DNA標(biāo)準(zhǔn)(DL2000);1：PCR產(chǎn)物;2：pET-28a(+)質(zhì)粒雙酶切;3：pET-28a(+)-Annexins B2重組質(zhì)粒雙酶切;M2：DNA標(biāo)準(zhǔn)(DL 15000)。圖2100g/L SDS-PAGE分析pET-28a(+)-Ta Annexins B2在大腸埃希菌中的表達(dá)產(chǎn)物及其純化產(chǎn)物Fig.2 100g/L SDS-PAGE analysis of the prokaryotic expression product and purified product

M：蛋白Marker;1：pET-28a(+)IPTG未誘導(dǎo);2：pET-28a(+)IPTG誘導(dǎo);3：pET-28a(+)-Annexins B2 IPTG未誘導(dǎo);4：pET-28a(+)-Annexins B2 IPTG誘導(dǎo);5：pET-28a(+)-Annexins B2上清;6：pET-28a(+)-Annexins B2沉淀;7：pET-28a(+)-Annexins B2純化蛋白。

3討論

帶絳蟲病的流行在我國西部一直是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。每年由帶絳蟲病造成的健康和畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)損失上百億，嚴(yán)重影響西部欠發(fā)達(dá)地區(qū)的社會(huì)發(fā)展。目前，亞洲帶絳蟲病的防治研究的重點(diǎn)集中在診斷和疫苗候選抗原、藥物靶標(biāo)、致病的分子機(jī)制研究。圖3重組蛋白的Western blotting 鑒定Fig.3 Western blotting analysis of the recombinantsM：蛋白Marker;1：純化蛋白與亞洲帶絳蟲患者血清的反應(yīng)結(jié)果;2：純化蛋白與牛帶絳蟲患者血清的反應(yīng)結(jié)果;3：純化蛋白與豬帶患者血清的反應(yīng)結(jié)果;4：純化蛋白與亞洲帶絳蟲感染豬血清的反應(yīng)結(jié)果;5：純化蛋白與正常人血清的反應(yīng)結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)通過生物信息學(xué)方法從已經(jīng)構(gòu)建好的亞洲帶絳蟲成蟲cDNA質(zhì)粒文庫中篩選出了一個(gè)膜聯(lián)蛋白(Annexins B2)的同源基因，并且預(yù)測(cè)出該基因位于胞漿，無跨膜區(qū)，二級(jí)結(jié)構(gòu)基本上是以α螺旋為主。這些都符合膜聯(lián)蛋白家族的共同特征[4]。根據(jù)膜聯(lián)蛋白家族分布廣泛，表達(dá)豐富且穩(wěn)定的特性，可以推測(cè)其在絳蟲的生理活動(dòng)中可能起著重要的作用。

膜聯(lián)蛋白是一個(gè)廣泛存在的蛋白家族，在所有真核基因組中廣泛表達(dá)。具有內(nèi)部重復(fù)單位和“G-X-G-T-(38residues)-D/E”基序[5]，即Ca2+結(jié)合區(qū)域的特征，用以結(jié)合帶有負(fù)電的脂質(zhì)。雖然它為鈣結(jié)合蛋白，但是在結(jié)構(gòu)上卻沒有EF手，而且在和Ca2+結(jié)合后，還可以與磷脂再次結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。例如，細(xì)胞的胞吞胞吐，離子通道的形成，調(diào)節(jié)磷脂酶A2的活性及細(xì)胞內(nèi)外Ca2+濃度、抗炎癥反應(yīng)等。在長(zhǎng)期的生物進(jìn)化過程中，膜聯(lián)蛋白家族各成員在生物學(xué)特性和生理功能方面表現(xiàn)出非常復(fù)雜的關(guān)系，且在研究過程中發(fā)現(xiàn)，annexins沒有信號(hào)肽，沒有跨膜結(jié)構(gòu)，是一個(gè)典型的細(xì)胞內(nèi)蛋白。但是，卻有學(xué)者發(fā)現(xiàn)它可以與細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生作用。例如，抗炎[6]、抗凝[7]、抑制腫瘤[8]等。最新的研究報(bào)道，當(dāng)將其作為疫苗的候選因子時(shí)，可以消除一些寄生于哺乳動(dòng)物體內(nèi)的寄生蟲。此外，學(xué)者們認(rèn)為膜聯(lián)蛋白是維持細(xì)胞膜表面結(jié)構(gòu)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的重要蛋白。并可能具有激活纖維蛋白酶原的功能，有助于破壞宿主的結(jié)締組織，使蟲體抗原更加容易進(jìn)入宿主機(jī)體，誘發(fā)免疫應(yīng)答。因此，對(duì)該基因的研究有助于進(jìn)一步了解它的生物學(xué)功能及開辟預(yù)防治療寄生蟲病的新途徑[9-10]。

目前，Annexins B2已經(jīng)在豬囊尾蚴的研究被發(fā)現(xiàn)并命名，但是具體的生理功能還不清楚，且在亞洲帶絳蟲研究領(lǐng)域還是空白。因此，本研究將亞洲帶絳蟲成蟲annexins克隆到原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒，在大腸埃希菌BL-21/DE3中用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物通過SDS-PAGE電泳進(jìn)行鑒定。SDS-PAGE結(jié)果表明，該蛋白在全菌和沉淀中都有表達(dá)，上清中有微量的表達(dá)，說明annexins主要表達(dá)在包涵體中。因此，進(jìn)一步溶解包涵體[11]，經(jīng)變性處理并親和層析純化后，得到了大量較純的重組蛋白。此外，還嘗試性的用上清過柱純化并用蔗糖進(jìn)行蛋白濃縮，也得到部分有活性的蛋白。Western blotting就是以抗體-抗原沉淀反應(yīng)為基礎(chǔ)的，可用于不同抗原的比較和定量。其檢測(cè)結(jié)果表明所獲得的重組蛋白與豬帶絳蟲、牛帶絳蟲及亞洲帶絳蟲有較強(qiáng)的交叉反應(yīng)且在絳蟲中的診斷特異性不高，推測(cè)其不能作為免疫診斷抗原的合適候選分子。但是，其具有免疫活性的高效表達(dá)。由此可推測(cè)它是一個(gè)具有開發(fā)潛力的基因?？傊?，本項(xiàng)研究填補(bǔ)了該蛋白在亞洲帶絳蟲研究領(lǐng)域的空白，也為進(jìn)一步研究該基因的生物學(xué)功能及在診斷尤其是疫苗研究方面奠定了基礎(chǔ)。

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第3篇

[關(guān)鍵詞] 國際標(biāo)準(zhǔn)化比值；口服抗凝藥；華法林；準(zhǔn)確性

[中圖分類號(hào)] R446.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2013）05（b）-0114-03

實(shí)驗(yàn)室的全面質(zhì)量控制（total quality control）指的是醫(yī)學(xué)臨床試驗(yàn)的過程中影響試驗(yàn)準(zhǔn)確性的因素，包括試驗(yàn)前質(zhì)量控制、試驗(yàn)中質(zhì)量控制、試驗(yàn)后質(zhì)量控制[1-2]。本文主要探討口服抗凝劑（oral anticoagulants）華法林（warfarin）監(jiān)測(cè)試驗(yàn)—凝血酶原時(shí)間（prothrombin time，PT）的國際標(biāo)準(zhǔn)化比值（international normalized ratio，INR）試驗(yàn)前及試驗(yàn)中質(zhì)量控制，以了解影響國際標(biāo)準(zhǔn)化比值準(zhǔn)確性的因素。

隨著人們生活水平和醫(yī)療水平的提高，東北地區(qū)心腦血管病患者呈逐年增加的趨勢(shì)，為了防止缺血性腦梗死和心臟瓣膜置換術(shù)以及冠心病合并房顫等患者出院后血栓的形成，患者均需口服華法林抗凝治療[3]。由于華法林治療劑量與中毒劑量十分接近，會(huì)出現(xiàn)出血的并發(fā)癥，所以這樣的患者要監(jiān)測(cè)凝血酶原時(shí)間的國際標(biāo)準(zhǔn)化比值（INR）。INR=（患者PT值/正常人平均PT值）ISI。ISI指國際敏感指數(shù)（international sensitivity index，ISI），ISI值越接近1，試劑對(duì)有關(guān)凝血因子降低的敏感度越高。由于患者不同生理狀態(tài)、飲食、服用藥物、合并疾病對(duì)口服華法林的影響[4]以及就診醫(yī)院所使用的儀器、試劑、操作方法的不同，同一患者不同時(shí)間或不同地點(diǎn)所測(cè)得的凝血酶原時(shí)間的國際標(biāo)準(zhǔn)化比值（INR）有所差異。因此，探討影響凝血酶原時(shí)間的國際標(biāo)準(zhǔn)化比值準(zhǔn)確性的因素十分必要。

本文主要從患者飲酒、合并疾病及合并使用藥物及不合格標(biāo)本的使用等方面對(duì)試驗(yàn)前和試驗(yàn)中的影響因素作一些探討，用以提高檢驗(yàn)工作的質(zhì)量。

1 資料與方法

1.1 一般資料

從2011年10月～2012年12月在本院住院或門診就診的62例患者，其中，心肌梗死患者預(yù)防血栓者16例，心臟瓣膜置換術(shù)后預(yù)防血栓者8例，冠心病合并房顫者9例，腦梗死預(yù)防血栓者15例，肺栓塞6例，靜脈血栓患者8例。年齡45～65歲，平均年齡56歲。其中，男性37例，女性25例。平均每個(gè)患者不同時(shí)間檢測(cè)7～9次PT和INR。其中27例口服華法林同時(shí)服用頭孢類抗生素，6例患者患有長(zhǎng)期腹瀉，8例患者長(zhǎng)期飲酒。

1.2 標(biāo)本采集

清晨空腹采取靜脈血，放于109 mmol/L枸櫞酸鈉抗凝管中，試劑與血液比例為1∶9，顛倒混勻4次。3000 r/s離心15 min，30 min內(nèi)分離，2 h內(nèi)完成對(duì)INR的測(cè)定。

1.3 儀器與試劑

儀器為Sysmex CA1500全自動(dòng)血凝儀，試劑由SIEMENS公司提供，凝血酶原時(shí)間試劑，批號(hào)是：LOT545369，ISI值為1.0。

1.4 比對(duì)實(shí)驗(yàn)

上述27例上感患者停用頭孢類類抗生素后重測(cè)，6例腹瀉治療后重測(cè)，8例飲酒者戒酒后重測(cè)，合計(jì)82例；標(biāo)本量不準(zhǔn)（過少）、溶血標(biāo)本、脂血標(biāo)本、標(biāo)本放置時(shí)間過久者重新采集符合要求的標(biāo)本重測(cè)合計(jì)92例。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，不合格標(biāo)本與重測(cè)標(biāo)本之間均數(shù)比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P < 0.01為差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 采血前患者狀態(tài)對(duì)INR的影響

選取停用頭孢類抗生素前后、腹瀉治療前后、戒酒前后INR值對(duì)比，見表1。1、2組INR對(duì)比，P值均為0.000，兩組結(jié)果差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；3、4組INR對(duì)比，P < 0.05，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；5、6組INR對(duì)比，P < 0.01，兩組差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？梢娍诜^孢類抗生素，腹瀉及飲酒對(duì)INR值有影響。

2.2 采血后不合格標(biāo)本及測(cè)定時(shí)間對(duì)INR的影響

標(biāo)本溶血、標(biāo)本量不足、未及時(shí)測(cè)定及這類標(biāo)本重采后重測(cè)結(jié)果對(duì)比，見表2。1、2組INR對(duì)比P < 0.05，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；3、4組INR對(duì)比，P < 0.05，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；5、6組INR對(duì)比，P < 0.01，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？梢姌?biāo)本溶血，采集的標(biāo)本量不足及標(biāo)本放置過久未及時(shí)測(cè)定對(duì)INR值有影響。

3 討論

3.1 采血前的因素對(duì)的凝血酶原時(shí)間的國際標(biāo)準(zhǔn)化比值的影響機(jī)制

采血前的因素對(duì)的凝血酶原時(shí)間的國際標(biāo)準(zhǔn)化比值的影響機(jī)制主要取決于這些因素對(duì)華法林藥效的影響[5]。華法林是香豆素類藥物的一種，是維生素K拮抗劑，它通過競(jìng)爭(zhēng)性抑制維生素K環(huán)氧化物還原酶起作用，使還原型維生素K不能合成。還原型維生素K的缺乏導(dǎo)致體內(nèi)凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ不能正常羧化，致使血液不能凝固[6]。有如下因素影響口服華法林的藥效，進(jìn)而影響凝血酶原時(shí)間（PT）及國際標(biāo)準(zhǔn)化比值（INR）。如患者的身高、體重、年齡的不同，導(dǎo)致華法林在體內(nèi)代謝的程度不同，比如體重大的人所需華法林劑量增大，高年齡的人華法林肝代謝率下降，所需華法林的劑量減少，如果仍使用標(biāo)準(zhǔn)劑量可導(dǎo)致出血。此外飲食、吸煙、飲酒、合并用藥（尤其影響肝藥酶代謝能力的藥物）對(duì)華法林最佳穩(wěn)定劑量產(chǎn)生不同程度的影響[7]。飲食中提供維生素K的食物（如芹菜、韭菜、海藻、花椰菜等）會(huì)降低華法林的作用；飲酒及同期有肝功能不足會(huì)增加華法林的作用；當(dāng)合并服用藥物如氯吡格雷、辛伐他汀、優(yōu)甲樂、苯溴馬隆、尼麥角林、西咪替丁、紅霉素、頭孢菌素，大劑量的青霉素，中藥如當(dāng)歸、銀杏葉、連翹、丹參可影響華法林的藥效。當(dāng)合并甲亢、甲減、腎功能不全、腹瀉時(shí)需嚴(yán)密監(jiān)測(cè)患者的臨床癥狀和INR。嚴(yán)重的腹瀉可導(dǎo)致維生素K吸收不足，從而增加華法林的藥效。

本試驗(yàn)選取口服頭孢類抗生素、腹瀉患者、長(zhǎng)期飲酒的溶栓適應(yīng)癥患者，采集他們口服藥物前后、腹瀉治療前后及戒酒前后標(biāo)本，測(cè)定凝血酶原時(shí)間及國際標(biāo)準(zhǔn)化比值進(jìn)行對(duì)比，表明這類因素對(duì)INR是有影響的。其中頭孢類抗生素可直接降低維生素K依賴性凝血因子（Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ）的合成，而這些凝血因子參與內(nèi)外源性凝血機(jī)制，使反應(yīng)外源性凝血的PT延長(zhǎng)，并使INR增高。其中腹瀉的患者，一方面食物中維生素K無法正常吸收，另一方面腸道細(xì)菌（如大腸桿菌）無法合成維生素K，可導(dǎo)致體內(nèi)的維生素含量減少，使華法林的藥效增加，增加凝血酶原時(shí)間。其中長(zhǎng)期飲酒的患者，引起肝功能不足，會(huì)增加華法林的作用，使凝血酶原時(shí)間和國際標(biāo)準(zhǔn)化比值增加。

3.2 溶血標(biāo)本、標(biāo)本量不足、未及時(shí)測(cè)定等對(duì)的凝血酶原時(shí)間的國際標(biāo)準(zhǔn)化比值的影響機(jī)制

標(biāo)本采集不順利、注入真空采血管中的血標(biāo)本劇烈震蕩或離心速度過大、時(shí)間過長(zhǎng)都可造成標(biāo)本溶血，標(biāo)本溶血造成INR的降低[8]。其中標(biāo)本量不足，造成抗凝劑與血液比例大于1∶9，相當(dāng)于抗凝劑用量過大，造成PT和INR增高。而標(biāo)本在室溫放置時(shí)間過久，可導(dǎo)致凝血因子Ⅷ和Ⅴ對(duì)熱不穩(wěn)定，使凝血因子活性逐漸降低，使INR增高。

綜上所述，影響凝血酶原時(shí)間的國際標(biāo)準(zhǔn)化比值測(cè)定結(jié)果的因素很多，無論是試驗(yàn)前還是試驗(yàn)中都要執(zhí)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制，以保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，最大程度的為臨床溶栓治療提供合理依據(jù)。

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第4篇

【摘要】 目的 觀察蟲草素對(duì)腫瘤壞死因子α(TNFα)刺激的離體大鼠血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)增殖和syndecan4蛋白表達(dá)的影響。 方法 體外培養(yǎng)大鼠胸主動(dòng)脈VSMCs，分別應(yīng)用終濃度為20 ng/mL TNFα、20 μmol/mL蟲草素、40 μmol/mL蟲草素、20 ng/mL TNFα+20 μmol/mL蟲草素、20 ng/mL TNFα+40 μmol/mL蟲草素作用24 h，并設(shè)對(duì)照組進(jìn)行比較。采用MTS/PMS法確定VSMCs的增殖狀態(tài)，利用Western blot蛋白免疫印跡法測(cè)定VSMCs中syndecan4蛋白的表達(dá)。結(jié)果 (1)與對(duì)照組比較，TNFα組能顯著刺激大鼠VSMCs的增殖(P0.05)。TNFα聯(lián)合蟲草素共同作用組與TNFα組比較， VSMCs增殖均顯著減少(P

【關(guān)鍵詞】 syndecan4;蟲草素;腫瘤壞死因子α;血管平滑肌細(xì)胞;細(xì)胞增殖

Abstract:Objective To investigate the effects of cordycepin on the proliferation of rat vascular smooth muscle cells(VSMCs)and expression of syndecan4 protein induced by tumor necrosis factorα(TNFα).Methods VSMCs were cultured in vitro and exposed to 20 ng/mL TNFα，20 μmol/mL cordycepin，40 μmol/mL cordycepin，20 μmol/mL cordycepin with 20 ng/mL TNFα，and 40 μmol/mL cordycepin with 20 ng/mL TNFα，respectively. All groups were treated for 24 h in vitro，in addition to the control group established for comparison. The ratio of proliferation of VSMCs was determined by nonradioactive MTS/PMS assay and the expression of syndecan4 protein was evaluated by Western blotting using antisyndecan4 antibody.Results (1) Compared to the control group，TNFα significantly stimulated the proliferation of rat VSMCs at the concentration of 20 ng/mL in TNFα group (P0.05)，but significantly inhibited VSMCs proliferation induced by TNFα (P

Key words:syndecan4; cordycepin; tumor necrosis factorα; vascular smooth muscle cells; cell proliferation

血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)增殖和表型改變是動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的主要病理基礎(chǔ)之一，動(dòng)脈粥樣硬化是對(duì)血管損傷的過度炎癥反應(yīng)。腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factoralpha，TNFα)是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一，可從多種不同的炎癥細(xì)胞中釋放，在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵的作用。Syndecan4是硫酸乙酰肝素(heparan sulfate，HS)類的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白多糖syndecans家族的成員之一。Syndecan4主要在血管平滑肌細(xì)胞上表達(dá)，它作為一種與生長(zhǎng)因子結(jié)合的共受體(coreceptor)，調(diào)控著多種細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)，在細(xì)胞的伸展、識(shí)別、黏附、遷移和增殖控制中扮演著重要的角色，同時(shí)也介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[1]。蟲草素(cordycepin)即3’脫氧腺苷，為含氮配糖體的核酸衍生物，為冬蟲夏草的主要藥理活性成分之一。研究表明蟲草素具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)等作用[2]。本研究觀察了蟲草素對(duì)TNFα誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖及syndecan4蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料

6周齡雄性SPF級(jí)SD大鼠，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào)：SCXK粵20060015);DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶均購自美國Gibco公司;胎牛血清(FBS)購自美國Hyclone公司;一次性96孔板購自美國Corning公司;TNFα購于美國Peprotech公司;蟲草素購于美國Sigma公司(1108582002);CellTiter 96 Assay MTS/PMS試劑盒購于美國Promega公司(G5421);一抗為兔抗大鼠syndecan4多克隆抗體H140，購置于美國Santa Cruz公司(sc15350);二抗為羊抗兔IgG抗體，購置于英國Amersham公司(NA934);ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購于美國Pierce公司(JE120872);其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 VSMCs的原代培養(yǎng)

參考王道生貼塊法[3]進(jìn)行。取SD大鼠胸主動(dòng)脈中膜，以貼塊法培養(yǎng)于含10%(φ)胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%的CO2孵箱中培養(yǎng)。2～3周出現(xiàn)致密細(xì)胞層后即可傳代，傳代細(xì)胞呈典型的“峰與谷”樣生長(zhǎng)。細(xì)胞經(jīng)使用抗αactin抗體鑒定為VSMCs，實(shí)驗(yàn)所用的VSMCs均為第3～6代傳代細(xì)胞。

1.3 增殖評(píng)價(jià)

體外培養(yǎng)的SD大鼠VSMC在96孔板中以5 000個(gè)細(xì)胞/孔的密度鋪板;8 h后，換成含1%FBS的DMEM培養(yǎng)基，維持48 h以獲得同步的細(xì)胞生長(zhǎng)停止;分別加入20 ng/mL TNFα、20 μmol/mL蟲草素、40 μmol/mL蟲草素、20 ng/mL TNFα+20 μmol/mL蟲草素、20 ng/mL TNFα+40 μmol/mL蟲草素。對(duì)照組為含5%FBS的DMEM培養(yǎng)基。24 h后細(xì)胞的增殖率通過應(yīng)用96 Assay MTS/PMS試劑盒確定。用BioRad 550型Microplate Reader以490 nm波長(zhǎng)測(cè)量吸光度(A)值，細(xì)胞的增殖率用A值表示。

1.4 Syndecan4蛋白免疫印跡測(cè)定

將體外培養(yǎng)的SD大鼠VSMCs分別用已配制好的試劑：20 ng/mL TNFα、20 μmol/mL蟲草素、40 μmol/mL蟲草素、20 ng/mL TNFα+20 μmol/mL蟲草素、20 ng/mL TNFα+40μmol/mL蟲草素刺激，對(duì)照組為5%FBS DMEM培養(yǎng)液。24 h后用DHanks液沖洗，冰上裂解細(xì)胞，收獲蛋白。取適量待檢測(cè)蛋白用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，將已分離的條帶電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，4 ℃封閉過夜，加入配置好的一抗(1∶200稀釋)、二抗(1∶10 000稀釋)孵育，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)。βactin檢測(cè)作為內(nèi)對(duì)照。實(shí)驗(yàn)?zāi)z片用光密度掃描儀掃描，結(jié)果用圖像軟件BIORAD Quantity One分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

各組A值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入和統(tǒng)計(jì)分析。采用析因方差分析，兩樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);多組均數(shù)比較采用單向方差分析;組間多重比較，方差齊性采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊采用GamesHowell檢驗(yàn)，P

2 結(jié) 果

2.1 蟲草素對(duì)TNFα誘導(dǎo)的大鼠VSMCs增殖的影響

MTS/PMS法測(cè)定各組細(xì)胞增殖率分別為：對(duì)照組0.666±0.098，TNFα 20 ng/mL組1.013±0.150，20 μmol/mL蟲草素組0.660±0.097，40 μmol/mL蟲草素組0.676±0.085，TNFα 20 ng/mL聯(lián)用20 μmol/mL蟲草素組0.662±0.107，TNFα 20 ng/mL聯(lián)用40 μmol/mL蟲草素組0.627±0.135。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，20 ng/mL TNFα組能明顯刺激大鼠VSMCs的增殖(P0.05)。20 μmol/mL蟲草素聯(lián)用20 ng/mL TNFα、40 μmol/mL蟲草素聯(lián)用20 ng/mL TNFα組與20 ng/mL TNFα組比較對(duì)VSMCs增殖均有明顯的抑制作用(P

以目的蛋白對(duì)照組灰度值與內(nèi)參對(duì)照組灰度值的比值為1，其余各組syndecan4蛋白表達(dá)量分別為：TNFα 20 ng/mL組1.375±0.017，20 μmol/mL蟲草素組1.009±0.120，40 μmol/mL蟲草素組1.002±0.050，TNFα 20 ng/mL+20 μmol/mL蟲草素組0.962±0.057， TNFα 20 ng/mL+40 μmol/mL蟲草素0.914±0.057(如圖2) 。與對(duì)照組比較，TNFα組能明顯刺激VSMCs的syndecan4蛋白表達(dá)(P0.05)。TNFα聯(lián)合蟲草素共同作用組與TNFα組比較對(duì)VSMCs的syndecan4蛋白表達(dá)均有顯著抑制作用(P

3 討 論

炎癥反應(yīng)貫穿于腦血管動(dòng)脈粥樣硬化的起始、病變進(jìn)展及斑塊破裂、血栓形成的全過程。TNFα是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一，TNFα主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生， [JP+1〗與正常細(xì)胞相比， 在動(dòng)脈粥樣硬化病

Figure 3 Effects of cordycepin on syndecan4 protein expression in rat vascular smooth muscle cells induced by TNFα變中其表達(dá)上調(diào)，在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊局部的血管平滑肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有TNFα的mRNA表達(dá)。血管平滑肌細(xì)胞表面具有TNFα受體，是TNFα作用的靶細(xì)胞。TNFα與血管平滑肌細(xì)胞上的相應(yīng)受體結(jié)合后可以促進(jìn)細(xì)胞的有絲分裂過程。

研究表明，syndecan4在炎癥及組織創(chuàng)傷愈合中發(fā)揮著重要的作用[4]。Syndecan4主要在血管平滑肌細(xì)胞上表達(dá)，其表達(dá)在動(dòng)脈損傷早期即可增加，隨后在7 d內(nèi)減少到可控制的水平。在內(nèi)皮組織裸露的動(dòng)脈，血管中層平滑肌syndecan4的mRNA占整個(gè)血管壁的70%～90%。Rauch [5]等研究發(fā)現(xiàn)syndecan4是凝血酶誘導(dǎo)人VSMC遷移和增殖反應(yīng)所必需的成分，凝血酶通過誘導(dǎo)sydnecan4蛋白的表達(dá)上調(diào)，從而激活p44/42 MAPK。Telci[6]等研究顯示，在組織損傷修復(fù)中，syndecan4可與纖維結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶復(fù)合物結(jié)合，激活蛋白激酶Cα后，syndecan4聚集并與β1整合素結(jié)合，激活細(xì)胞存活機(jī)制及RGD依賴的細(xì)胞黏附，從而導(dǎo)致MAPK途徑激活及肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維形成。Houston[7]等報(bào)告了氧化型亞油酸能夠刺激大鼠和人的VSMC增殖并上調(diào)syndecan4的表達(dá)。新近的研究提示，syndecan4作為一種重要的跨膜蛋白，是信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞內(nèi)部的重要傳遞者，也是細(xì)胞外信號(hào)引起細(xì)胞增殖反應(yīng)的重要遞呈者。位于細(xì)胞表面的syndecan4主要通過激活蛋白激酶Cα參與細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)。在細(xì)胞因子等致動(dòng)脈粥樣硬化因素的刺激下，syndecan4通過硫酸乙酰肝素鏈與胞外的配體相結(jié)合，并調(diào)節(jié)其活性，經(jīng)保守的跨膜區(qū)傳導(dǎo)進(jìn)入胞內(nèi)，在其胞質(zhì)尾區(qū)發(fā)生一系列的去磷酸化作用及寡聚化作用，使syndecan4與PIP2的親和力增強(qiáng)，從而激活了蛋白激酶Cα，進(jìn)一步激活了p44/42 MAPK，從而啟動(dòng)了大多數(shù)促細(xì)胞增殖的共同途徑ERK途徑。至于TNFα是如何影響syndecan4蛋白的表達(dá)，Zhang[8]等的實(shí)驗(yàn)證明了主要是通過兩種機(jī)制來實(shí)現(xiàn):一種是通過NFκВ介導(dǎo)的方式來增加syndecan4的基因表達(dá);另一種是延長(zhǎng)syndecan4mRNA的半衰期。

冬蟲夏草是名貴中藥材，具有多種藥理作用，《本草從新》中記載：“保肺益腎，止血化痰，止勞嗽?！?冬蟲夏草味甘、性平，歸肺腎二經(jīng)。主要功效為補(bǔ)腎陽、益腎精、補(bǔ)肺氣、祛痰止咳、平喘。蟲草素為冬蟲夏草的主要藥理活性成分之一，具有免疫調(diào)節(jié)作用、抗炎作用及抗腫瘤等作用。Zhou[9]等進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)蟲草素能通過促進(jìn)人外周單核細(xì)胞白介素10的分泌和白介素10 mRNA的表達(dá)來參與抗炎反應(yīng)。De Jong [10]等發(fā)現(xiàn)蟲草素能通過誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增殖來影響炎癥反應(yīng)。近年來發(fā)現(xiàn)，蟲草素對(duì)轉(zhuǎn)錄因子NFκВ的抑制作用是其發(fā)揮抗炎作用的重要機(jī)制。NFκВ是合成蛋白的重要轉(zhuǎn)錄因子。蟲草素抑制了NFκВ的從胞漿到核內(nèi)易位和表達(dá)。在Kim [11]等的實(shí)驗(yàn)中，為了明確蟲草素的抗炎機(jī)制，檢測(cè)了脂多糖激活的RAW264.7巨噬細(xì)胞中Akt和MAP激酶的活性，在劑量依賴模式中，蟲草素能顯著抑制巨噬細(xì)胞中Akt和p38MAPK激酶的磷酸化，從而抑制了NFκВ從胞漿到核內(nèi)的易位;除了通過抑制上述兩種激酶而影響NFκВ外，蟲草素還可以抑制轉(zhuǎn)錄因子抑制劑IκB alpha 的磷酸化，延長(zhǎng)其降解時(shí)間。蟲草素通過抑制NFκВ的作用，導(dǎo)致 iNOS和COX2基因表達(dá)下調(diào)，使NO產(chǎn)物的生成減少，最終的結(jié)果是抑制了炎癥反應(yīng)。YoungRae Lee[12]等人也證明了蟲草素可以通過抑制NFκВ而完全限制了受紫外線激發(fā)的表皮成纖維細(xì)胞中MMP1和MMP3的表達(dá)。因此，可以推測(cè)蟲草素通過影響眾多細(xì)胞因子的表達(dá)而發(fā)揮抗炎作用，而它對(duì)NFκВ的抑制作用是其中關(guān)鍵的一環(huán)。本實(shí)驗(yàn)提示一定劑量的蟲草素能夠顯著抑制TNFα誘導(dǎo)的VSMCs增殖和syndecan4蛋白表達(dá)。推測(cè)可能的機(jī)制是TNFα通過與VSMCs表面的相應(yīng)TNF受體結(jié)合，使NFκВ的表達(dá)和易位增加，從而在基因水平使syndecan4蛋白的表達(dá)增加，隨后激活p44/42MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞增殖，而蟲草素可能通過阻斷TNFα介導(dǎo)的NFκВ的易位和表達(dá)，從而使TNFα誘導(dǎo)的syndecan4蛋白的表達(dá)下降，減少蛋白激酶Cα的激活，從而進(jìn)一步抑制p44/42MAPK的磷酸化，最終導(dǎo)致大鼠VSMCs增殖的減少。

綜上所述，本研究表明一定劑量的蟲草素能夠顯著抑制TNFα誘導(dǎo)的大鼠VSMC增殖和syndecan4蛋白表達(dá)。因此，有必要進(jìn)一步研究蟲草素抑制syndecan4蛋白表達(dá)的相關(guān)潛在靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

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第5篇

【摘要】 【目的】 觀察當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清對(duì)氧化低密度脂蛋白(OxLDL)激活小鼠單核細(xì)胞系RAW2647細(xì)胞中核轉(zhuǎn)錄因子κBp65(NFκBp65)mRNA表達(dá)的影響?！痉椒ā繉⑿挛魈m兔8只隨機(jī)分為空白血清組和含藥血清組，每組各4只，分別灌胃生理鹽水和當(dāng)歸補(bǔ)血湯水煎液(劑量為84 g·kg-1·d-1)，分離血清。將RAW2647細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h，分為空白對(duì)照組、OxLDL組、PAR組(終濃度為10 μmol/L的小菊白內(nèi)酯)、體積分?jǐn)?shù)10%的含藥血清組。除空白對(duì)照組外，其他各組分別加入100 μg/mL OxLDL刺激4 h，收集細(xì)胞。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞NFκBp65 mRNA的表達(dá)量?！窘Y(jié)果】 OxLDL組與空白對(duì)照組比較，NFκBp65 mRNA的表達(dá)量增加(P< 005);含藥血清組與OxLDL組比較，NFκBp65 mRNA的表達(dá)量減少(P< 005)?！窘Y(jié)論】 當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清能下調(diào)NFκBp65 mRNA的表達(dá)量，抑制、阻斷NFκBp65的表達(dá)可能是當(dāng)歸補(bǔ)血湯抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制之一。

【關(guān)鍵詞】 當(dāng)歸補(bǔ)血湯/藥理學(xué);動(dòng)脈粥樣硬化/中藥療法;信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo);基因表達(dá)調(diào)控;細(xì)胞培養(yǎng)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis， AS)是導(dǎo)致心腦血管疾病發(fā)生的重要病理改變，而氧化低密度脂蛋白(oxidized lowdensity lipoprotein， OxLDL)對(duì)AS的發(fā)生發(fā)展起著非常重要的作用。在動(dòng)脈內(nèi)膜下，低密度脂蛋白經(jīng)氧化修飾成OxLDL，后者可以抑制低密度脂蛋白與其受體結(jié)合，抑制巨噬細(xì)胞的移動(dòng)，致使局部OxLDL大量堆積，形成泡沫細(xì)胞，從而加速As的形成[1]。Brand等[2]發(fā)現(xiàn)AS病灶粥樣硬化斑塊內(nèi)膜和中膜的平滑肌細(xì)胞及巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞里均有活化的核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factorkappa B，NFκB)。NFκB可能是啟動(dòng)AS的關(guān)鍵因子[3]，由血管壁LDL的修飾到引發(fā)炎癥和趨化因子的釋放、內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)等程序?qū)е聠魏思?xì)胞向待損害部位聚集，NFκB都參與了其中[4-6]。當(dāng)歸補(bǔ)血湯目前已被廣泛應(yīng)用于AS及其相關(guān)疾病的治療，療效確切，具有降低血脂和抗氧化損傷的效應(yīng)，能夠明顯減輕由OxLDL引起的單核細(xì)胞的趨化作用[7-9]。為探討該方抗AS的作用機(jī)理，本研究觀察了其含藥血清對(duì)OxLDL激活小鼠單核細(xì)胞系RAW2647細(xì)胞中NFκBp65 mRNA表達(dá)的影響?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

11主要儀器及試劑BNA3210型CO2培養(yǎng)箱(日本ESPEC公司)，SWCJ1FD型超凈工作臺(tái)(中國蘇州凈化設(shè)備公司)，AXIOVERT 200倒置顯微鏡(日本ZEISS公司)，ABI3900臺(tái)式高通量DNA合成儀(美國ABI公司)，ABI7300熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，Sigma3k18型高速低溫離心機(jī)(美國Sigma公司)，小菊白內(nèi)酯(Parthenolide，PAR;美國Santa cruz 公司，批號(hào)：sc3523)，RPMI1640培養(yǎng)基(美國Invitrogen公司，批號(hào)：12491015)，胎牛血清(美國Invitrogen公司，批號(hào)：10099158)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(中晶公司，批號(hào)：K1621)，總RNA提取試劑(Trizol Reagent，美國Invitrogen公司，批號(hào)：15596026)。

12實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康新西蘭大耳白兔共8只，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(粵)20030001，雌雄各半，3～4月齡，體質(zhì)量15～20 kg。

13當(dāng)歸補(bǔ)血湯水煎液的制備黃芪、當(dāng)歸均使用道地藥材，為甘肅產(chǎn)品，購自廣東省藥材公司并加以鑒定。按照《內(nèi)外傷辨惑論》原方中黃芪和當(dāng)歸以質(zhì)量比5∶1的配伍比例稱取生藥，以每g生藥加水6 mL，冷水浸泡30 min，煮沸后再文火慢煎40 min，趁熱過濾，濾液自然滴盡，第2煎按每g生藥加水4 mL，煎法同前，合并濾液，95 ℃水浴濃縮成含生藥084 g/mL的水煎液，4℃保存。

14血清制備8只兔隨機(jī)分為空白血清組和含藥血清組，每組4只，分別灌胃生理鹽水和當(dāng)歸補(bǔ)血湯水煎液，實(shí)際灌胃劑量按動(dòng)物體表面積換算得出，臨床等效劑量為168 g/kg，按每kg體質(zhì)量每天灌胃量為5倍臨床等效劑量即84 g·kg1·d1，連續(xù)灌胃3 d，第4天上午于禁食12 h后灌胃1次，1 h后乙醚麻醉動(dòng)物，無菌條件下心臟采血，將抽取的血液室溫下靜置3 h，離心，取上清，56 ℃水浴中滅活，022 μm微孔濾器過濾除菌，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

15細(xì)胞培養(yǎng)將RAW2647細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃ 、體積分?jǐn)?shù)5% 的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d換液1次。細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后可傳代，用25 g/L的胰酶乙二胺四乙酸消化處于生長(zhǎng)旺盛期的單層培養(yǎng)細(xì)胞，再用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為3×104 /cm2，再培養(yǎng)。

16實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)RAW2647細(xì)胞中NFκBp65 mRNA的表達(dá)量從Gen Bank上查找和對(duì)比目的基因，設(shè)計(jì)引物：Mouse GAPDH：上游引物5AACAGGGTGGTGGACCTCAT3;下游引物5GGGATAGGGCCTCTCTTGCT3。Mouse NFκBp65：上游引物5ACGCGGATTCCTGTACACCT3;下游引物5CAGGAGCTCCACAGGACAGA3。合成引物。

17實(shí)驗(yàn)分組及處理實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、OxLDL組、PAR組、含藥血清組。調(diào)整細(xì)胞懸液密度5×104/cm2，按分組接種于24孔板中，每組4個(gè)復(fù)孔。在37℃ 、體積分?jǐn)?shù)5% CO2飽和濕度下培養(yǎng)24 h。棄去原培養(yǎng)液，以磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞2～3次。空白對(duì)照組、OxLDL組加含體積分?jǐn)?shù)10%空白血清的RPMI1640培養(yǎng)液孵育24 h;PAR組加含體積分?jǐn)?shù)10%空白血清的RPMI1640培養(yǎng)液孵育24 h，再加入終濃度為10 μmol/L PAR預(yù)處理2 h;含藥血清組加含體積分?jǐn)?shù)10%含藥血清的RPMI1640培養(yǎng)液孵育24 h。除空白對(duì)照組外，其他各組分別加入100 μg/mL OxLDL刺激4 h。抽提RNA：棄原培養(yǎng)液，不洗，每孔各加500 μL 總RNA提取試劑，吸打混勻。室溫靜置5 min。加100 μL氯仿，劇烈震蕩15 s。室溫靜置5 min。4℃、12 000 r/min離心15 min，此時(shí)溶液分為3層，取上清液，移至新離心管中，加250 μL異丙醇，混勻，室溫靜置10 min。4℃、12 000 r/min離心8 min。棄上清，加入500 μL 體積分?jǐn)?shù)75%乙醇洗沉淀，4℃、12 000 r/min離心5 min，風(fēng)干5 min。焦碳酸二乙酯(DEPC)溶解沉淀，-70℃保存。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：加RNA樣品11 μL，六聚物引物1 μL入PCR小管，吸打混勻。放入PCR儀中，70℃、5 min。取出加入5倍反應(yīng)緩沖液4 μL、RNA酶抑制劑1 μL、三磷酸脫氧核糖核苷(dNTP) 混合液 2 μL，吸打混勻。放入PCR儀中，25℃、5 min。取出加入逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL，吸打混勻。放入PCR儀中，25℃、10 min，42℃、60 min，70℃、10 min。熒光定量PCR反應(yīng)：準(zhǔn)備96孔板，按上述分組，每組各4個(gè)復(fù)孔，25 μL反應(yīng)體系，依次加入蒸餾水101 μL、熒光染料混合液125 μL、上游引物02 μL、下游引物02 μL、樣品溶液2 μL。吸打數(shù)次混勻，稍離心。放入PCR儀，95℃、15 s，60℃、60 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，由電腦自動(dòng)分析并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品及內(nèi)參的基因拷貝數(shù)。

18統(tǒng)計(jì)學(xué)方法結(jié)果以鴨乙肝病毒為標(biāo)準(zhǔn)品，計(jì)算樣品目的 mRNA拷貝數(shù)與內(nèi)參照三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH) mRNA拷貝數(shù)的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)采用SPSS 130 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果

RAW2647細(xì)胞NFκBp65 mRNA表達(dá)的變化：各組溶解曲線峰值較集中，未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增(圖1-c、圖2-c，彩圖見第556頁)。各組內(nèi)參照GAPDH cDNA擴(kuò)增循環(huán)數(shù)較集中，提示各組樣品濃度較接近(圖2-b，彩圖見第556頁);各組NFκBp65 cDNA擴(kuò)增循環(huán)數(shù)差距明顯(圖1-b，彩圖見第556頁)，提示各組NFκBp65 mRNA表達(dá)量有明顯差異。表1結(jié)果顯示：OxLDL組與空白對(duì)照組比較差異有顯著性意義(P

3討論

NFκB通路是一條重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與了多種生理病理過程的調(diào)節(jié)。其與AS的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，已成為國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行抗AS研究所高度重視的一個(gè)藥理學(xué)作用靶點(diǎn)。OxLDL首先激活NFκB上游激酶，引起級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終活化NFκB，使其轉(zhuǎn)入核內(nèi)，引起相關(guān)基因的表達(dá)，啟動(dòng)一系列炎癥因子的基因轉(zhuǎn)錄，而炎癥因子的過度表達(dá)又會(huì)加重NFκB的活化[10]。NFκB家族成員以不同組合形成異源二聚體，每一個(gè)NFκB蛋白均有特殊的作用，其中p65/p50異聚體在大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中大量存在，p65含有強(qiáng)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，與AS的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[11]。因此，本實(shí)驗(yàn)觀察了當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清對(duì)OxLDL誘導(dǎo)的RAW2647細(xì)胞中p65 mRNA表達(dá)的影響，探討當(dāng)歸補(bǔ)血湯是否通過NFκBp65起到抗AS作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：OxLDL可明顯激活RAW2647細(xì)胞中的NFκB通路，當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清能下調(diào)NFκBp65 mRNA表達(dá)。

綜上所述，在AS發(fā)生的早期脂質(zhì)浸潤(rùn)、泡沫細(xì)胞形成過程中，NFκB通路發(fā)揮著重要作用，當(dāng)歸補(bǔ)血湯可能通過調(diào)節(jié)該通路以調(diào)控相關(guān)致炎因子的表達(dá)進(jìn)而影響AS的發(fā)生發(fā)展，抑制、阻斷NFκB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能是當(dāng)歸補(bǔ)血湯抗AS損傷作用的機(jī)制之一。

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第6篇

愉快的暑假到了，為了使自己的假期生活過的健康充實(shí)，歡樂而有意義，我特別為自己的暑假生活制定了具體的計(jì)劃。我的計(jì)劃大概分為兩個(gè)方面：學(xué)習(xí)計(jì)劃、生活計(jì)劃。

第一，學(xué)習(xí)計(jì)劃，具體如下：

1.爭(zhēng)取7月1日至7月20日完成語、數(shù)、外三門暑假作業(yè)。計(jì)劃大概每天完成6面暑假作業(yè)。

2.預(yù)習(xí)語文六年級(jí)上冊(cè)的古詩詞，文言文，日積月累等等。并有重點(diǎn)的選擇背誦。

3.預(yù)習(xí)六年級(jí)上冊(cè)數(shù)學(xué)相關(guān)內(nèi)容。

4.預(yù)習(xí)六年級(jí)上冊(cè)英語的課程，默寫有關(guān)單詞，聽磁帶。

5.每天看課外書，報(bào)紙，還可以看看動(dòng)畫片，但時(shí)間不能太長(zhǎng)。

6.寫暑假日記一本，作文10篇，練好鋼筆字。

第二，生活計(jì)劃具體如下：

1.培養(yǎng)個(gè)人的生活能力，比如：做飯、洗衣服。幫父母干一些力所能及的家務(wù)活，掃掃地，給父母捶捶背，幫父母買點(diǎn)東西等等。

2.要注意個(gè)人安全等方面問題，不私自下河游泳，不能私自外出，不做危險(xiǎn)違法的事。

3.要每天鍛煉身體，堅(jiān)持跑步，每個(gè)星期天去爬一次山。每個(gè)星期六去游泳館游泳一次。每天還要早起，不睡懶覺。如果父母不在家，不能給陌生人開門，不跟陌生人講話.。見人要有禮貌。

這就是我的暑假計(jì)劃，我相信只要認(rèn)真執(zhí)行這些計(jì)劃我就一定能過一個(gè)美好，愉快的暑假!

小學(xué)生暑假計(jì)劃【2】

一、時(shí)間安排

1、每天的四個(gè)“1小時(shí)保障”

每天保障做一小時(shí)的語文或數(shù)學(xué)寒假作業(yè);

每天保障一小時(shí)的無負(fù)擔(dān)課外閱讀;

每天保障一小時(shí)的英語自學(xué);

每天保障一小時(shí)的戶外活動(dòng)或運(yùn)動(dòng)。

2、計(jì)劃與非計(jì)劃

如無特殊情況，每天必須完成以上計(jì)劃;

每天的計(jì)劃在得到“保障”的前提下，可靈活自由安排;

如果因外出旅游、回鄉(xiāng)下度假等意外安排，可臨時(shí)不予執(zhí)行;

可以偶爾睡懶覺，但不要影響當(dāng)日計(jì)劃的實(shí)施。

二、學(xué)習(xí)計(jì)劃

1、不參加語文、數(shù)學(xué)的培優(yōu)，不請(qǐng)家教，相關(guān)課程自己獨(dú)立完成。

2、語文課程計(jì)劃

7月份完成暑假作業(yè)，8月中旬前檢查、改正，查漏補(bǔ)缺;

把自己的藏書系統(tǒng)再讀一遍，重點(diǎn)讀歷史、百科知識(shí)大全、漫畫、中外名著導(dǎo)讀等叢書;

假期可以自己買三本自己喜歡的任何書籍;

把以前稍顯薄弱的閱讀題的規(guī)范回答、錯(cuò)別字系統(tǒng)復(fù)習(xí)。

3、數(shù)學(xué)課程計(jì)劃

7月份完成暑假作業(yè)，8月中旬前檢查、改正，查漏補(bǔ)缺;

假期完成五年級(jí)《奧數(shù)提高班》的自學(xué)，基本掌握其要領(lǐng)，有選擇性挑選典型題目做。

自己注意計(jì)算細(xì)心化的糾正。

4、英語課程計(jì)劃

英語學(xué)習(xí)能力和成績(jī)一般，要重點(diǎn)加強(qiáng)學(xué)習(xí)興趣和能力的培養(yǎng);

把三年級(jí)和四年級(jí)的學(xué)校課本系統(tǒng)復(fù)習(xí)一遍，每天堅(jiān)持聽劍橋英語的磁帶，時(shí)間不限;

假期把以前記得的英語單詞都記在小本子上，分類匯總;

若有興趣、有機(jī)會(huì)，可以把語音和音標(biāo)接觸、鞏固一下，盡量保證發(fā)音標(biāo)準(zhǔn)。

三、活動(dòng)安排

1、隨父母至少省內(nèi)出去旅游一次，爭(zhēng)取省外旅游去一次;

2、至少去鄉(xiāng)下親戚家2次，體驗(yàn)生活，其中爺爺家族親戚去一次，外公家族親戚去一次;

3、每天保障一小時(shí)的戶外活動(dòng)或運(yùn)動(dòng)，散步、溜冰、找小朋友玩等，要注意安全;

4、每?jī)商熘辽賻图依镒鲆患覄?wù)事(10分鐘以上)，洗衣服、擇菜、簡(jiǎn)單做飯等;

5、一個(gè)人嘗試獨(dú)立在家呆1-2天;邀請(qǐng)同學(xué)或者小朋友在家玩若干次，并獨(dú)立招待;

6、每周玩電腦2小時(shí)左右，重點(diǎn)加強(qiáng)打字能力的提高;

第7篇

暑假到了，媽媽為了挖掘我的英語潛力，和我共同制定了學(xué)習(xí)計(jì)劃：天背兩個(gè)單元的單詞并默寫。自從計(jì)劃開始以后，我的社會(huì)便變得忙碌起來。

媽媽先教我學(xué)習(xí)音標(biāo)。再教我26個(gè)英文字母，我經(jīng)常把英文字母里的“r”語濱拼音里的“a”弄混。媽媽便讓我從前往后默寫，還打亂順序給我聽寫我終于能熟練地掌握26個(gè)英文字母的大小寫了。

接下來該背單詞了。開始我很盲目，讀十幾遍都背不過，心里想：就這么一個(gè)小小的單詞便讓我苦惱，那后面那么多單詞，我那年那月才能背過呢？我急的都快哭出聲了。媽媽走過來，語重心長(zhǎng)地對(duì)我說：“崔煜東，你怎么了？”我說：“我記不住英語單詞！”媽媽說：“沒關(guān)系，我來教你怎么記。”媽媽先在所有的單詞上注上音標(biāo)，再把方法告訴我：比如but這個(gè)單詞，“b”發(fā)“／b／”的音，“u”發(fā)／a／的音，“t”發(fā)／t／的音。連起來讀就是／bat／拼寫就是but。

自從用了媽媽教我的方法，我背單詞快多了。備課文、默寫課文也流利多了，每次都順利通過媽媽的檢查?，F(xiàn)在又有一個(gè)好朋友魏志遠(yuǎn)加入了我的隊(duì)伍。

雖然英語占用了我很多的時(shí)間，但是我樂意，因?yàn)镮likeEnglishverymuch！

第8篇

考研英語詞匯app較好的有：

1、考研詞匯速記：可以智能制定學(xué)習(xí)計(jì)劃，有詞匯分組，單詞擴(kuò)展，以及例句，更利于記憶。支持音標(biāo)顯示、語音朗讀，智能循環(huán)記憶。詞義緩出，先單詞再中文，是方便易用的單詞軟件；

2、英語方舟考研：智能提供適合你的單詞列表，只背不會(huì)的單詞，節(jié)約學(xué)習(xí)時(shí)間，提高學(xué)習(xí)效率；

3、滬江開心詞場(chǎng)：科學(xué)的MAP記憶法提供全方位單詞記憶，讓背詞效果更好，效率更高?？梢噪S時(shí)和微信及QQ里面的好友進(jìn)行單詞PK。生詞本提供多種便捷復(fù)習(xí)方式鞏固記憶。

（來源：文章屋網(wǎng) ）

第9篇

1、每天的四個(gè)“1小時(shí)保障”

每天保障做一小時(shí)的語文或數(shù)學(xué)寒假作業(yè)。

每天保障一小時(shí)的無負(fù)擔(dān)課外閱讀。

每天保障一小時(shí)的英語自學(xué)。

每天保障一小時(shí)的戶外活動(dòng)或運(yùn)動(dòng)。

2、計(jì)劃與非計(jì)劃

如無特殊情況，每天必須完成以上計(jì)劃。

每天的計(jì)劃在得到“保障”的前提下，可靈活自由安排。

如果因外出旅游、回鄉(xiāng)下度假等意外安排，可臨時(shí)不予執(zhí)行。

可以偶爾睡懶覺，但不要影響當(dāng)日計(jì)劃的實(shí)施。

二、學(xué)習(xí)計(jì)劃

1、不參加語文、數(shù)學(xué)的培優(yōu)，不請(qǐng)家教，相關(guān)課程自己獨(dú)立完成。

2、語文課程計(jì)劃。

7月份完成暑假作業(yè)，8月中旬前檢查、改正，查漏補(bǔ)缺。

把自己的藏書系統(tǒng)再讀一遍，重點(diǎn)讀歷史、百科知識(shí)大全、漫畫、中外名著導(dǎo)讀等叢書。

假期可以自己買三本自己喜歡的任何書籍。

把以前稍顯薄弱的閱讀題的規(guī)范回答、錯(cuò)別字系統(tǒng)復(fù)習(xí)。

3、數(shù)學(xué)課程計(jì)劃。

7月份完成暑假作業(yè)，8月中旬前檢查、改正，查漏補(bǔ)缺。

假期完成五年級(jí)《奧數(shù)提高班》的自學(xué)，基本掌握其要領(lǐng)，有選擇性挑選典型題目做。

自己注意計(jì)算細(xì)心化的糾正。

4、英語課程計(jì)劃。

英語學(xué)習(xí)能力和成績(jī)一般，要重點(diǎn)加強(qiáng)學(xué)習(xí)興趣和能力的培養(yǎng)。

把三年級(jí)和四年級(jí)的學(xué)校課本系統(tǒng)復(fù)習(xí)一遍，每天堅(jiān)持聽劍橋英語的磁帶，時(shí)間不限。

假期把以前記得的英語單詞都記在小本子上，分類匯總。

若有興趣、有機(jī)會(huì)，可以把語音和音標(biāo)接觸、鞏固一下，盡量保證發(fā)音標(biāo)準(zhǔn)。

三、活動(dòng)安排

1、隨父母至少省內(nèi)出去旅游一次，爭(zhēng)取省外旅游去一次。

2、至少去鄉(xiāng)下親戚家2次，體驗(yàn)生活，其中爺爺家族親戚去一次，外公家族親戚去一次。

3、每天保障一小時(shí)的戶外活動(dòng)或運(yùn)動(dòng)，散步、溜冰、找小朋友玩等，要注意安全。

4、每?jī)商熘辽賻图依镒鲆患覄?wù)事（10分鐘以上），洗衣服、擇菜、簡(jiǎn)單做飯等。

5、一個(gè)人嘗試獨(dú)立在家呆1-2天。邀請(qǐng)同學(xué)或者小朋友在家玩若干次，并獨(dú)立招待。

6、每周玩電腦2小時(shí)左右，重點(diǎn)加強(qiáng)打字能力的提高。