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重組酶介導(dǎo)的隱孢子蟲屬特異性等溫核酸擴增方法的建立及評價

摘要:目的建立一種可用于隱孢子蟲檢測的重組酶介導(dǎo)的等溫核酸擴增(RAA)方法,并對其檢測敏感性和特異性進(jìn)行評價。方法以隱孢子蟲屬特異性18S rRNA核酸序列作為檢測靶標(biāo),采用Amplfix軟件設(shè)計、合成引物及熒光檢測探針,構(gòu)建并優(yōu)化RAA熒光反應(yīng)體系;分別以不同拷貝數(shù)的含18S rRNA靶序列的重組質(zhì)粒、不同濃度隱孢子蟲卵囊基因組DNA及不同數(shù)量隱孢子蟲卵囊基因組DNA為模板進(jìn)行RAA熒光法檢測,以評價其敏感性;分別以隱孢子蟲卵囊、藍(lán)氏賈第鞭毛蟲包囊、日本血吸蟲蟲卵、似蚓蛔線蟲蟲卵、華支睪吸蟲蟲卵、沙門氏菌、志賀氏菌基因組DNA為模板進(jìn)行RAA熒光法檢測,以評價其特異性。結(jié)果成功建立了隱孢子蟲檢測RAA法,該方法可在39℃、20 min內(nèi)得到隱孢子蟲屬18S rRNA基因片段的有效擴增。以不同拷貝數(shù)的含18S rRNA靶序列的重組質(zhì)粒、不同濃度隱孢子蟲卵囊基因組DNA及不同數(shù)量隱孢子蟲卵囊基因組DNA為模板,該方法最低檢出限分別為102拷貝/μL、1 pg/μL和1個/50μL;以藍(lán)氏賈第鞭毛蟲包囊、日本血吸蟲蟲卵、似蚓蛔線蟲蟲卵、華支睪吸蟲蟲卵、沙門氏菌、志賀氏菌基因組DNA為模板的熒光RAA擴增結(jié)果均為陰性。結(jié)論成功建立了一種可用于檢測隱孢子蟲卵囊DNA的RAA法,該方法操作簡便、反應(yīng)快速,敏感性和特異性均較好。

關(guān)鍵詞:
  • 隱孢子蟲  
  • 核酸檢測  
  • 重組酶介導(dǎo)的等溫擴增法  
  • 熒光探針  
  • 檢測效能  
作者:
倪碧嫻; 吳小珉; 劉燕紅; 徐祥珍; 應(yīng)清界; 曹俊; 戴洋
單位:
國家衛(wèi)生健康委員會寄生蟲病預(yù)防與控制技術(shù)重點實驗室、江蘇省寄生蟲與媒介控制技術(shù)重點實驗室、江蘇省血吸蟲病防治研究所; 無錫214064; 江南大學(xué)公共衛(wèi)生研究中心; 江蘇省奇天生物科技有限公司
刊名:
中國血吸蟲病防治

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期刊名稱:中國血吸蟲病防治

中國血吸蟲病防治雜志緊跟學(xué)術(shù)前沿,緊貼讀者,國內(nèi)刊號為:32-1374/R。堅持指導(dǎo)性與實用性相結(jié)合的原則,創(chuàng)辦于1989年,雜志在全國同類期刊中發(fā)行數(shù)量名列前茅。