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摘要：本研究旨在優(yōu)化組織培養(yǎng)法分離小鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived stem cells,ASCs),為研究成骨分化和成脂分化在間充質(zhì)干細(xì)胞分化過程中的相互影響奠定基礎(chǔ)。通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞生長曲線和流式儀器檢測所分離獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞的特性,利用CRISPR-dCas9系統(tǒng)在快速促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的前提下觀察其對成脂分化的影響,并通過生化染色、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫細(xì)胞學(xué)等手段進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,接種3~5 d后可見細(xì)胞從組織塊周圍爬出,光鏡下可見細(xì)胞形態(tài)多為成纖維細(xì)胞樣的梭形細(xì)胞,且形態(tài)單一均勻,具有較高的爬出率,可以大大提高脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離效率;通過CRISPR-dCas9系統(tǒng)激活Runx 2和Osterix基因后可以促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化,實(shí)時(shí)熒光定量PCR及油紅O染色結(jié)果顯示,CRISPR-dCas9系統(tǒng)可以同時(shí)抑制間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂分化;通過CRISPR-dCas9-KRAB系統(tǒng)同時(shí)抑制成骨相關(guān)基因Runx 2和Osterix后可以促進(jìn)成脂分化。本研究利用組織貼壁法成功獲得了高純度的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞,具有間充質(zhì)干細(xì)胞的特性和分化能力;利用CRISPR系統(tǒng)可以同時(shí)過表達(dá)Runx 2和Osterix兩個(gè)基因,可以在進(jìn)成骨分化的同時(shí)抑制成脂分化,表明成脂分化和成骨分化的相關(guān)性,為基因編輯在間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化和臨床應(yīng)用方面提供了新的思路和方法。