摘要：目的利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)建立巴馬小型豬胚胎成纖維細(xì)胞(porcine fetal fibroblasts,PFFs)α-1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)/β-1,4 N-乙酸氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶(β-1,4 N-acetylgalactosaminyltransferase,β4GalNT2)雙基因敲除細(xì)胞系,為構(gòu)建α-1,3-半乳糖(α-1,3-galactose,α-Gal)和SD(a)抗原缺失的巴馬小型豬模型奠定基礎(chǔ)。方法分別選取豬GGTA1基因的第三外顯子和β4GalNT2基因的第八外顯子為敲除靶點(diǎn),利用在線工具(crispr.mit.edu)設(shè)計(jì)并合成單導(dǎo)向RNA(single guide RNA,sgRNA),以含有Cas9基因的pX330質(zhì)粒為骨架構(gòu)建打靶載體,轉(zhuǎn)染野生巴馬小型豬的PFFs,用T7EN1酶切驗(yàn)證打靶載體敲除效率。將打靶載體與G418抗性質(zhì)粒(tdTomato)共轉(zhuǎn)染巴馬小型豬PFFs,經(jīng)藥物篩選獲得陽性單細(xì)胞克隆后測序鑒定基因型。結(jié)果成功構(gòu)建靶向GGTA1和β4GalNT2基因的Cas9/sgRNA表達(dá)載體。轉(zhuǎn)染PFFs后用藥物篩選得到31個(gè)單克隆細(xì)胞系,其中5個(gè)為GGTA1/β4GalNT2雙基因敲除的細(xì)胞系。結(jié)論Cas9/sgRNA表達(dá)載體可以高效編輯PFFs的GGTA1/β4GalNT2基因并獲得了雙基因敲除的單細(xì)胞克隆,為構(gòu)建GGTA1/β4GalNT2敲除的巴馬小型豬提供必需的實(shí)驗(yàn)材料。
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期刊名稱：實(shí)用器官移植電子
實(shí)用器官移植電子雜志由人民衛(wèi)生出版社有限公司主辦，國家衛(wèi)生健康委員會(huì)主管的學(xué)術(shù)刊物，國內(nèi)刊號(hào)為：11-9334/R。創(chuàng)辦于2013年，（刊期），在全國同類期刊中發(fā)行數(shù)量名列前茅。其主要欄目有：稿約、器官移植病理研究進(jìn)展_衛(wèi)生健康事業(yè)發(fā)展70年巡禮、器官移植病理研究進(jìn)展_標(biāo)準(zhǔn)與規(guī)范、器官移植病理研究進(jìn)展_學(xué)術(shù)活動(dòng)預(yù)告、器官移植病理研究進(jìn)展_視頻之窗等。