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摘要：Crustin是一系列富含半胱氨酸的甲殼動(dòng)物來(lái)源的抗菌肽,是甲殼動(dòng)物非特異性免疫機(jī)制中的重要免疫因子,其生物學(xué)功能由C端的成熟肽區(qū)域決定。參考三疣梭子蟹( Portunus trituberculatus ) PtCrustin2成熟肽的cDNA序列,根據(jù)畢赤酵母( Pichia pastoris )的密碼子偏愛性對(duì)其相關(guān)密碼子進(jìn)行優(yōu)化,合成5′端含 Xho Ⅰ限制性位點(diǎn)和Kex2信號(hào)肽酶切位點(diǎn)、3′端含 Xba Ⅰ限制性位點(diǎn)和6×his標(biāo)簽的目的基因“ smPtCrustin2 ”;以pPICZαA為表達(dá)載體,構(gòu)建重組表達(dá)載體pPICZαA- smPtCrustin2,將其轉(zhuǎn)入畢赤酵母X-33細(xì)胞后,通過(guò)含高濃度博來(lái)霉素的抗性平板篩選高拷貝甲醇利用快速型酵母轉(zhuǎn)化子;篩選獲得的酵母轉(zhuǎn)化子在28 ℃、250 r/min條件下,使用0.5%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白,并通過(guò)固化金屬離子親和層析(IMAC)對(duì)其進(jìn)行分離純化。Tricine-SDS-PAGE分析顯示:純化的重組體smPtCrustin2的分子量約為9.6 ku,并形成分子量約20 ku的二聚體。Western Blot分析進(jìn)一步證明了純化產(chǎn)物為預(yù)期的目的蛋白。建立的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)獲得了表達(dá)量為22.4 mg/L的重組體smPtCrustin2。