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摘要：針對(duì)小鼠ERO1α基因構(gòu)建短發(fā)卡RNA(Short hairpin RNA,shRNA)慢病毒載體。根據(jù)NCBI中小鼠ERO1α基因序列,設(shè)計(jì)3條針對(duì)ERO1α的shRNA序列和1條陰性對(duì)照shRNA序列。將shRNA序列連接到慢病毒載體pCD513B-U6上,同時(shí)進(jìn)行PCR鑒定及測(cè)序,分別命名為pCD513B-ERO1α-shRNA和pCD513B-NC-shRNA。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒和包裝輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞,包裝產(chǎn)生慢病毒。將所得病毒懸液進(jìn)行濃縮,同時(shí)梯度稀釋轉(zhuǎn)導(dǎo)HEK 293T細(xì)胞,檢測(cè)病毒滴度。濃縮后的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞,通過(guò)RT-qPCR和Western blot技術(shù)進(jìn)行有效片段的篩選。之后,將篩選的慢病毒轉(zhuǎn)到多種細(xì)胞系或者原代細(xì)胞,用RT-qPCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)ERO1α基因的表達(dá)情況。PCR及測(cè)序結(jié)果表明,重組慢病毒干擾載體pCD513B-ERO1α-shRNA構(gòu)建成功,所包裝的慢病毒其病毒滴度為5×10^7 TU/mL~10×10^7 TU/mL。RT-qPCR和Western blot結(jié)果表明,pCD513B-ERO1α-shRNA-3抑制ERO1α表達(dá)的效果最好,干擾效率在80%左右。pCD513B-ERO1α-shRNA-3能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)多種細(xì)胞,并顯著抑制ERO1α的表達(dá),干擾效率在70%~90%。成功構(gòu)建針對(duì)小鼠ERO1α基因的shRNA重組慢病毒載體,為進(jìn)一步研究ERO1α功能奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。